Strona
Główna

Badania
Molekularne

Analiza
Statystyczna

Analiza
Informatyczna

Linki
Kontakt

Forum
Dyskusyjne



Usłyszałem i zapomniałem
Zobaczyłem i zapamiętałem
Zrobiłem i zrozumiałem

Konfucjusz

Zobaczyć DNA!


          Proces wydobywania, czyli ekstrakcji DNA z komórki jest pierwszy krokiem poprzedzającym wiele procedur laboratoryjnych w genetyce molekularnej. Naukowcy są aktualnie wstanie oddzielić cząsteczki DNA od niechcianych substancji komórkowych na tyle precyzyjnie by DNA nie zostało zniszczone. My też możemy to zrobić w domowej kuchni. Cząsteczki DNA są największymi spośród znanych cząsteczek, jest to również najbardziej fascynująca ze wszystkich składników komórek. Można, więc wykorzystać jej ogromną wielkość do tego by zobaczy ją gołym okiem. Przeprowadzając ekstrakcje DNA w laboratorium przed różnymi analizami jak na przykład PCR, możemy zobaczyć tą "boską nić życia" gołym okiem. Możliwość zobaczenia DNA jest kusząca, nie wszyscy mamy jednak szanse w takim laboratorium przebywać, możemy natomiast mimo to pochwalić się, że DNA widzieliśmy na własne oczy.
          Kilka podstawowych informacji powinno nam pomóc w zobaczeniu DNA uzyskanego własnymi rękami. Skoro DNA znajduje się w jądrze komórkowym każdej komórki, to trzeba najpierw je stamtąd wyciągnąć. Jeżeli zniszczymy kapsułkę, jaką jest otoczka komórkowa to odsłonimy i umożliwimy manipulacje makromolekuły DNA.
          Materiał biologiczny, który posłuży nam jako źródło DNA musimy najpierw rozdrobnić. Im dokładniej to zrobimy tym więcej komórek oddzieli się od jednolitej struktury tkankowej a więc więcej komórek zostanie wystawione na działanie kolejnych etapów naszej ekstrakcji. Do rozdrobnienia możemy użyć na przykład; wyciskarki do czosnku, wszelkiego rodzaju maszynek do mielenia stosowanych w kuchni, bardzo dobry efekt daje stosowanie miksera czy sokowirówki, można użyć też piasku o bardzo drobnej strukturze. Ten ostatni można uzyskać przez przesiewanie i rozdział na podstawie szybkości opadania w wodzie. Pamiętać jednak należy, że powinniśmy go przez użyciem wyprażyć, ze względu na przeogromną liczbe mikroorganizmów na jego powierzchni. W przypadku mało uwilgoconego materiału dodajemy wodę. Po ukończonym rozdrabniania otrzymujemy papkę, którą możemy poddać kolejnym procesom. Inny sposób to rozdrabnianie w niezbyt małe kawałki i poddawanie takich kawałków działaniu buforu. Dopiero tutaj rozdrabnianie struktury materiału zostaje zakończone. Ma to na celu ograniczenie degradacji DNA.
          Do niszczenia osłon komórkowych posłużą detergenty z łaciny. detergens, -ntis, czyli rozbijający od detergere, czyli ścierać, zerwać, rozbić. Związki takie stosujemy do różnego rodzaju środków czyszczących, gdyż wykazują one wysoką aktywność powierzchniową dzięki posiadaniu przynajmniej jednej grupy hydrofilowej i jednej hydrofobowej.
          Cząsteczki detergentu takiego jak choćby mydło, posiadają w swej strukturze część hydrofilową, która w roztworze z woda zwraca się w jej kierunku i część hydrofobową zwróconą przeciwnym kierunku. Dzięki temu zawsze elementy hydrofobowe dożą z wielką siłą do siebie, jeśli znajdują się w roztworze wody. Jeżeli więc w tym samym roztworze, co detergent znajdują się inne substancje hydrofilne jak np. tłuszcze to fragmenty hydrofobowe detergentu będą z ogromna "determinacją" dożyły do kontaktu z nimi. Może to być tłuste zabrudzenie lub też tłuszcz na powierzchni żywej komórki. Otoczenie takiej grudki tłuszczu przez detergent powoduje powstawanie emulsyjnych struktur łatwo porywanych do roztworu. Błona komórkowa jest wybiórczo przepuszczalną błoną zbudowaną z cząsteczek fosfolipidów i białek. Fosfolipidy zaś to cząsteczki tłuszczów złożonych, stanowią bardzo ważny składnik błon biologicznych, budując dwu warstwową część lipidową. Jeżeli więc detergent napotka na strukturę komórkową to będzie porywał z niej wszystkie elementy tłuszczowe, przez co zdestabilizuje całość i doprowadzi do jej rozpadu. I o to nam chodzi. Detergent odgrywa jeszcze jedna funkcje obok rozrywania ścian komórkowych. Rozbija również duże białka ułatwiając degradacje. Dzieje się to znów dzięki zjawisku wkręcania się hydrofilowych części do struktur białka, które również mają fragmentu hydrofilowe i fobowe. DNA nie występuje w komórce w formie wolnej, jest natomiast cały czas połączone z białkom stabilizującymi, które buduje między innymi wspólnie z DNA chromosomy. Rozbijając białka oczyszczamy w pewnym stopniu z nich nas interesujące makromolekuły, czyli DNA.
          Dalszy część procesu polega na pozwoleniu by molekularna zawartość wypłynęła z komórek do zrobionego przez nas buforu. Pierwszy składnik tego buforu już znamy, jest to detergent. Możemy tu zastosować prawie każdy dostępny w domu środek myjący, płyn do naczyń, szampony do mycia włosów, ale im prostszy tym lepszy. Oznacza to, że powinien zawierać jak najmniej środków dodatkowych na przykład zapachowych czy barwiących. Mydło zawiera tych środków dużo, ale za to zastosowanie szarego mydła gwarantuje obecność samego detergentu. Do około 10 ml, czyli jednej łyżki takiego detergentu dodajemy, jakieś 5 g. sody oczyszczonej oraz ćwierć łyżeczki, czyli 1,5 g. soli kuchennej. Dopełniamy to do objętości 100 ml wodą, najlepiej destylowaną, by nie zawierała jonów wapnia i magnezu, czyli była miękka. Rozpuszczając sól i sodę należy mieszać ostrożnie by nie zapienić roztworu. Tak przygotowany roztwór bufory najlepiej schłodzić. Wkładamy go w tym celu do lodówki, natomiast manipulacji nim przy doświadczeniu możemy trzymać go w łaźni z lodem, czyli po prostu szklankę z buforem wkładamy do większego pojemnika z lodem z zamrażarki. Zyskamy wtedy na powolniejszej degradacji naszego "cennego" DNA.
          Zawartość soli w buforze wytwarza jony w postaci, których sól w wodzie się rozpuszcza. Dzięki dodatnim jonom DNA jest zobojętniane poprzez przyciąganie ich do ujemnych ładunków na powierzchni kwasu deoksyrybonukleinowego. Zobojętnienie to umożliwia zbliżenie się do siebie fragmentów DNA. Regulując stężenie soli regulujemy wzajemne relacje zbliżania i oddalania od siebie kwasów nukleinowych.
          Teraz poddajemy naszą organiczną papkę działaniu schłodzonego buforu. Stosunek powinien wynosić jak jedna część papki do dwóch części buforu. Najlepiej 5 ml papki i 10 ml oziębionego buforu. By działanie bufory na komórki było dokładne należy to teraz dokładnie i energicznie wymieszać przez jakieś najmniej 3 minuty. Jeśli wybraliśmy metodę niezbyt drobnych kawałków, wtedy możemy to wszystko włożyć do łaźni wodnej o temperaturze 55 - 60°C na 10 - 12 minut pamiętając by nigdy nie przekraczać 15 gdyż spowoduje to rozpad DNA. Detergent rozkłada teraz cząsteczki lipidowe, które trzymają błony komórki razem. Dzięki temu DNA może przedostać się do roztworu. Detergent, łącznie z traktowaniem roztworu podwyższoną temperaturą, powoduje, że lipidy i białka, uwalniają nam "nagie" DNA. Teraz możemy szybko ochłodzić roztwór poprzez zanurzenie go w kąpieli wodnej z lodem na 5 minut.
          W naszym roztworze powinno już zajść wypłukanie makromolekuł z komórek do buforu. Jednak jak widzimy mamy jedynie roztwór o konsystencji zupy, w którym pływają większe elementy organiczne. Trzeba je oddzielić najprościej jest, więc odfiltrowywanie za pomocą filtra do kawy i późniejsze ewentualne odlanie klarownego roztworu. Nalewając mieszaninę na filtr, unikamy wlewania tam piany. Proces filtrowania może trwać godzinę lub dłużej, więc można cały zestaw zostawić na ten czas w lodówce.
          Najlepiej jednak było by gdyby możliwe było użycie jakiejś mikrowirówki domowej roboty. Obroty nie muszą być duże a czas to około 5 minut chodzi jedynie o oddzielenie grubych fragmentów tkanek. Jeżeli mamy już, co najmniej 5 ml klarownego roztworu, w którym mamy nadzieje jest DNA to możemy przystąpić do dalszej pracy.
          Liczymy na to, że w roztworze znajduję się DNA jednak pewni możemy być, że są w nim inne cząsteczki, których w cale nie chcemy. Teraz potrzebna nam jest związek, którego nie używamy tradycyjnie w kuchni, czyli izopropanol. Również teraz należy pamiętać by był on bez dodatków zapachowych i barwnikowych, ma mieć też jak najwyższe stężenie. Czysty izopropanol kupić można w aptece jako środek odkażający lub w sklepach z elektroniką czy optyką gdyż jest środkiem czyszczącym. Stosując w tej procedurze alkohol należy schłodzić go do jak najniższej temperatury. Teraz należy około 10 ml izopropanolu ostrożnie umieścić na powierzchni roztworu, możemy to zrobić przelewając go bardzo powoli po ściance, ale najlepiej zrobić to słomką do napojów służącą jako pipeta. Powolne spuszczanie izopropanolu strużką po przechylonej ściance naczynia umożliwia warstwowe rozgraniczenie buforu od mniej gęstego izopropanolu, który będzie na powierzchni. DNA nie rozpuszcza się w alkoholu i jeśli poczekamy 2 - 3 minuty bez wstrząsania pojawia się w nim w postaci kłaczkowatej
          Teraz możemy spróbować wyciągnąć DNA z roztworu, za pomocą cienkiej pałeczki czy patyczka czy drucika najlepiej z zakrzywioną końcówką. Bardzo delikatnie przeprowadzamy ją przez warstwę alkoholu aż do buforu, w której powinna być nieco zanurzona. Przesuwamy ją w górę i w dół jednocześnie powoli obracając. Jeśli nasze DNA nie jest zbyt zdegradowane to znajduję się tam długie odcinki DNA, które nawiną się na pałeczkę. Mniejsze niestety pozostaną w roztworze. Po jakiejś minucie możemy przenieść takie DNA pałeczką do czystego buforu bez detergentu i w ten sposób będziemy mieli możliwość oglądania pod światło cząsteczek DNA. Pomimo niedoskonałości umożliwia nam to oglądanie może nie czystego, ale jednak DNA. Zresztą część zanieczyszczeń białkowych czy RNA umożliwia nam lepsze uwidocznienie cząsteczek.
          Pozostałe w roztworze krótkie DNA również możemy spróbować zobaczyć. Jest ono niestety na tyle rozproszone, że gołym okiem było by to trudne. Jednak po dodaniu barwników wiążących się z DNA takich jak błękit metylenowy możemy i zauważyć takie DNA. Zdobycie takich barwników nie jest trudne gdyż stosowane są one w akwarystyce. Błękit znajdziecie w sklepach akwarystycznych. Bardzo popularne w akwarystyce są preparaty zawierające zieleń malachitową czy właśnie błękit metylenowy jako preparaty lecznicze. Słyną z tego, że po przypadkowym rozlaniu tworzą trudno zmywalne plamy. Można poeksperymentować używając ich do wybarwiania kwasów nukleinowych.
          Piszemy tu o uzyskiwaniu DNA przede wszystkim z tkanek roślinnych, możliwe jednak, że ktoś bardzo, ale to bardzo chce zrobić to samo z DNA zwierzęcym. Proszę bardzo można spróbować uzyskać własne DNA. Próbką DNA będzie materiał własny.
          Znów przygotowujemy bufor z połowy łyżeczki soli, około 10 ml detergentu i wody destylowanej w ilości 100 ml. Źródłem DNA będą komórki wewnętrznej części policzków. Stosuje się je np. do badań na potwierdzenie ojcostwa. Wewnętrzną powierzchnię policzków pociera się wtedy specjalnymi wacikami przypominającymi patyczki do uszu jednak znacznie dłuższymi. Takie waciki są poddawane późniejszej analizie a raczej komórki, które zastały przez nieściągnięte z policzków.
          Możemy jednak użyć wacików do uszu delikatnie oskrobując wewnętrzną część policzków. Najlepiej byłoby gdyby były to sterylne patyczki. Te w sklepowych działach kosmetycznych nie są sterylne, takie dostępne są natomiast w sklepie medycznym. Teraz taki patyczek mocno i energicznie płuczemy w probówce z kilkoma mililitrami wody destylowanej, musi to być zrobione dokładnie, więc uderzamy i pocieramy wacikiem o wewnętrzne ścianki probówki by jak najwięcej zebranych komórek przedostało się do wody. Waciki przeznaczone specjalnie do tego celu produkuje kilka firm, za darmo można uzyskać je zamawiając je na stronie www.GeneTree.com
          Lepiej jednak po prostu wziąć około 25 ml wody destylowanej i płukać nią przez około 30 sekund usta, uważając by jej nie połknąć. Możemy teraz wypluć zawartość jamy ustnej do naczynia. Na 2 ml wypłuczyn dodajemy 1 ml oziębionego buforu i kilkakrotnie mieszamy uważając by zbytnio nie spienić roztworu. Dalsze postępowanie z zmrożonym alkoholem jest takie jak w przypadku powyższym.
          Jak nie trudno się domyśleć ilość DNA, jaką możemy uzyskać z komórek policzka jest niewielka i nie nadaje się do bezpośredniej obserwacji. Więc może spróbujemy ją powiększyć tak jak robi się to w laboratoriach molekularnych, wiemy, że służy temu Polimerazowa Reakcja Łańcuchowa.
          Wyjaśnimy teraz jak niedrogimi metodami można przeprowadzić reakcję łańcuchową polimerazy PCR. Jedyny trudny warunek to uzyskanie kilku odczynników i primerów. Jeśli jednak ktoś je będzie miał może spróbować przeprowadzić reakcje PCR bez amplifikatora. Na początku konstrukcje automatów do przeprowadzania PCR, przypominały roboty przemysłowe, które za pomocą mechanicznych ramion przenosiły probówki z mieszaniną reakcyjną pomiędzy łaźniami wodnymi. W różnych łaźniach panowały odmienne warunki termiczne odpowiednie dla danego etapu amplifikacji. Dzięki temu bardzo szybko zmieniana była temperatura, co jest niezmiernie ważne dla powodzenia reakcji. My zamiast robotów użyjemy własnych rąk i nimi będziemy przenosić probówki do różnych łaźni.
          Reakcje PCR można przeprowadzić w warunkach amatorskich jednak pamiętać należy o tym, że technika ta jest niezmiernie wrażliwa na zanieczyszczenia. Nie obędzie się, więc bez jednorazowych gumowych rękawiczek do kupienia w aptece czy każdym sklepie ze sprzętem medycznym. Wszystkie szklane naczynia użyte w doświadczeniu muszą być dokładnie myte i płukane. Nie obędzie się bez zamykanych korkiem probówek bądź też ependorfów z własnym zamknięciem. Właśnie takie techniki analiz zalecane są dla naukowców pracujących w terenie w krajach najuboższych, jeśli nie ma funduszu na prawdziwy profesjonalny sprzed do laboratorium.
          Musimy teraz zniszczyć błony komórkowe nabłonka jam policzkowych. Robimy to ostrożnie gotując wodę przez około 2 minuty. Ma to na celu otwarcie komórek i wypłynięcie z nich materiału genetycznego. Oczywiście oprócz DNA uwalniamy także inne makromolekuły będące składnikiem komórek. Po ochłodzeniu do temperatury pokojowej musimy oddzielić fragmenty struktur komórkowych od cząsteczek rozpuszczonych w wodzie. Stosujemy do tego mikrowirówki, więc przyda się tu jakaś amatorska konstrukcja. Po wirowaniu otrzymujemy próbkę, którą możemy przechowywać w lodzie.
          Następny problem to odmierzanie niewielki ilości płynu. Drogie pipety nie wchodzą w grę, więc rozwiązaniem może być zastosowanie plastikowych rurek np. słomek do napojów czy pustych wkładów od długopisów. Ważne by były przezroczyste, i należy je wcześniej skalibrować. Pomocna w tym może być strzykawka "insulinówka".
          Teraz jednak najtrudniejsza rzecz, czyli wykonanie mixu PCR. Tych składników w kuchni nie znajdziemy, więc w tym miejscu kończy się całkowita amatorszczyzna. Być może komuś wpadnie w ręce zestaw, "demo" czyli darmowy reklamowy komplet odczynników do pojedynczych analiz. Bufor utrzymuje stałe pH reakcji, primery są krótkimi fragmentami DNA więżącymi się z określonymi miejscami na ludzkim DNA i definiują, gdzie rozpocząć ma prace polimeraza, która to składa dNTPy. Magnez stabilizuje całość reakcji enzymatycznej.
          Jeśli pokonaliśmy tę trudność możemy przystąpić do dalszej pracy. Przygotowujemy kilka probówek z mieszanina reakcyjną i dodajemy do nich nasz roztwór DNA. Pamiętamy by do jednaj z probówek nie dodawać DNA tylko zostawić sam PCR mix. Pozwoli nam ona sprawdzić czy nasza analiza nie jest zanieczyszczona obcym DNA. Teraz możemy rozpocząć proces PCR. Zamiast drogiego termocyklera zastosujemy łaźnie wodne, pomiędzy którymi przenosić będziemy próbki. W ten sposób będziemy przeprowadzać reakcje w sposób przypominający początki tej metody. Niezbędne okażą się łaźnie wodne zrobione przy pomocy sprzętu akwarystycznego.
          Rozpoczynamy cykl PCR przez rozdzielenie DNA w wysokiej temperaturze, czyli w około 94°C. Podwójna helisa denaturuje, czyli rozwinie się i rozdzieli na pojedyncze nici po około minucie. Zamykamy teraz probówki by ograniczyć parowanie i zaczynamy kolejne etapy.
          Obniżamy teraz temperaturę do około 60°C na około 90 sekund. W tym momencie primery powinny oflankować sekwencje w rozdzielonych niciach DNA. Następnie podnosimy temperaturę do 72°C na kolejne 90 sekund, pozwalamy by termostabilna polimerazę rozpoczęła syntezę nowych nici. Cykl taki powtarzamy 30 razy.
          Po owych trzydziestu cyklach powinniśmy uzyskać zwielokrotnienie nałożonego materiału genetycznego, we wszystkich probówkach oprócz kontrolnej. Jeśli w niej znajduje się DNA oznacza to, że nasza analiza została zanieczyszczona obcym DNA. Oczywiście nie robiliśmy tej analizy w celach stricte naukowych, więc mówi się trudno i próbujemy zobaczyć to, co mamy.

          c.d.n.