Strona
Główna

Badania
Molekularne

Analiza
Statystyczna

Analiza
Informatyczna

Linki
Kontakt

Forum
Dyskusyjne



Pobieranie materiału biologicznego i ekstrakcja DNA


          Makromolekuły DNA występują w zwierzęcych komórkach w dwu organellach, czyli w jądrze i centrach energetycznych, czyli mitochondriach. Izolując DNA zawsze izolujemy właśnie DNA jądrowe z kilkuprocentową domieszką mitochondrialnego. Najczęściej izolacje DNA wykonujemy genomowe krwi genomowe właśnie genomowe krwią wszystkim kojarzy się ta procedura. Pamiętać należy, że główny składnik krwi, czyli erytrocyty są właściwie w procesie izolacji DNA usuwane z pobranej próbki. Powodem jest to, że czerwone krwinki krwi są bez jądrzaste za wyjątkiem niedojrzałych. Nie możemy, więc z nich uzyskać żadnego DNA jądrzastego.
          Wiadomym jest, że DNA znajduje się w każdej komórce a więc każda pobrana przez nas tkanka jest potencjalnym źródłem makromolekuł DNA. Ogromna różnorodność tkanek oraz specyfika są powodem, dla którego niektóre z nich nadają się do tego lepiej a niektóre gorzej. Tkanka płucna jest na przykład bardzo często tak zabrudzona drobna frakcją zanieczyszczeń pochodzenia atmosferycznego, że uzyskany preparat to ciemna koloidalna zawiesina. Wszech obecna tkanka tłuszczowa z powody swej roli magazynu tłuszczu jest maźliwa, więc również utrudnia to homogenizacje. Nie trudno się domyśleć, że tkanka kostna jest zbyt twarda do takiego procesu. Próbki narządów wewnętrznych szczególnie tych związanych w jakiś sposób z trawieniem i rozkładem substancji organicznych mogą zawierać właśnie substancje degradujące interesujące nas cząsteczki DNA. Na przykład wątroba zawiera nukleazy, które degradują DNA. Śledziona jako narząd krwiotwórczy zawiera duże ilości hemu do syntezy hemoglobiny, niestety hem jest inhibitorem dla reakcji PCR.
          Czasem do badań wykorzystywane są wymazy. Wykonać je można za pomocą gotowych przeznaczonych do wymazów wymazówek lub w wypadku ich braku można posłużyć się wymazówkami do uszu, dostępnymi w każdej aptece. Po pobraniu wymazu zbędny patyczek należy obciąć a watkę umieścić w probówce. Metoda wymazu z wewnętrznej powierzchni policzka stosowana jest na przykład przez firmę GeneTree zajmującą się testowaniem ojcostwa u ludzi. Próbki pobierana są za pomocą właśnie takich 10cm patyczków, które wkłada się do koperty i odsyła do firmy. (www.GeneTree.com)

          Skoncentrujmy się jednak na razie na ekstrakcji DNA pochodzącego z krwi obwodowej. Już jeden mililitr takiej krwi wystarczy nam do wykonania badań diagnostycznych. Pamiętać należy, że jednorazowo pobrana ilość krwi do analiz musi być jak najmniejsza by nie wywołać anemizacji żywego zwierzęcia. Szczególnie ważne jest to u zwierząt małych jako myszy, szczury, chomiki itp. Doświadczalnie ustalona, że ilość takiej krwi pobranej od zwierzęcia powinna być nie większa niż 0,5 ml/kg jego ciężaru ciała. Jeśli pobieranie krwi od tego samego zwierzęcia ma odbyć się wielokrotnie należy zachowywać tygodniowe odstępy. Na szczęście przy badaniach DNA nie musimy się o to martwić. Warunek ten dotyczy innych analiz i oznaczeń biochemicznych wykonywanych na krwi.

          Przed przystąpieniem do pobrania krwi, należy zwierzęciu zapewnić bezpieczeństwo podczas takiego zabiegu. Chwytamy zwierze w sposób uzależniony od gatunku i wielkości i unieruchamiamy by gwałtowne ruchy nie powodowały bólu podczas pobierania krwi, co tylko dodatkowo wywoływałoby stres. Stres i zmęczenie może wywołać dodatkowy wyrzut erytrocytów do krwi obwodowej, co tylko zwiększa ilość materiału, który w późniejszej obróbce będzie musiał być odrzucony. Ułatwianie pobierania krwi polega na nagrzewaniu miejsc skąd zamierzamy krew pobrać. Sposobów jest kilka może to być nagrzewanie wodą o temperaturze 45OC, do której zanurzymy ogon myszy czy szczura, bądź też żarówka emitująca podczerwień, czy też masaż jako samodzielna metoda bądź połączony z którąś z poprzednich metod.
          By nie dopuścić do zakrzepnięcia krwi stosujemy środki zapobiegająca. Heparyna ze względu na właściwość inhibitora niektórych enzymów restrykcyjnych jest tutaj mniej pożądana. Stosowanym środkiem jest EDTA. EDTA to skrót związku będącego solą dwusodową kwasy wersenowego, lub znanego jako kwas etylenodiaminotetraoctowy, (HOOC-H2C)2N-CH2-CH2-N(CH2-COOH)2). EDTA jest to aminokwas tworzący kompleksy chelatowe przy pomocy 4 atomów tlenu i 2 atomów azotu, z jonami większości metali. Chelacja jest procesem powodującym wiązanie metali lub minerałów takich jak ołów, rtęć, żelazo, aluminium, wapń i innych z inną substancją, czyli w tym przypadku z EDTA. Takim związkiem chelatynowym jest hemoglobina, czerwony barwnik znajdujący się we krwi, uczestniczącym w wymianie gazowej przenosząc tlen i dwutlenek węgla jest związkiem chelatowym dla żelaza. Stosując EDTA jako czynnik helatujący zapobiegamy degeneracji DNA w wyniki działania DN-azy.


Ten sam wzór po lewej w formie półstrukturalnej i strukturalnej po prawej.

          Uzyskaną krew powinniśmy podać analizie w ciągu 24 godzin przetrzymywania temperaturze 4°C. Jeśli zamierzamy przechowywać krew dłużej powinniśmy ją zamrozić w temperaturze od -20°C do -80°C. Krew przechowujemy odpowiednich probówkach Można do transportu i przechowywania użyć strzykawek. Małe strzykawki o pojemności do 2 ml mogą służyć do pobrania krwi jak też jako probówki transportowe.
          Możemy teraz zabrać się do izolacji DNA. Naszym celem izolując DNA jest uzyskanie maksymalnej ilości i czystości makromolekuł kwasu deoksyrybonukleinowego. Mówimy wtedy o wydajności i uzyskiwaniu jak największej ilości DNA z próbki przy braku w uzyskanym preparacie zbędnych białek i inhibitorów enzymów stosowanych przy obróbce, jaka odbywa się na uzyskanym materiale genetycznym.
          Główne etapy izolacji DNA z krwi obwodowej to; liza komórek nieposiadających jąder i ich odrzucenie z surowicą jako zbędne zanieczyszczenia. Zebranie interesujących nas leukocytów, ich przemywanie i lizowanie, oraz odbiałczanie przez ekstrakcje fenolem i chloroformem. I wreszcie wytracanie DNA alkoholem izopropylowym. Prócz metod profesjonalnych opracowano również kilka metod izolacji DNA dla celów pokazowych amatorskich. Dzięki właściwościom chemicznym kwasu deoksyrybonukleinowego możliwe jest amatorskie izolowanie DNA.
          By przybliżyć praktyczne metody izolacji DNA przedstawimy tutaj kilka oryginalnych przepisów na ten proces.

Izolowanie DNA za pomocą zestawu MasterPure DNA Purification Kit

          1. Najpierw umieszczamy w probówkach Eppendorfa 200 ml krwi i dodajemy 600 ml odczynnika "A" (czerwony korek - Red Cell Lysis Solution),
          2. Zawartość mieszamy poprzez trzykrotne odwracanie probówki i inkubujemy w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Po tym czasie zawartość ponownie mieszamy i inkubujemy przez kolejne 5 minut,
          3. Po kolejnym mieszaniu zawartości wirujemy ją przez 45 sekund przy 12000 obr/min,
          4. Usuwamy pipetą automatyczną powstały supernatant , pozostawiając na dnie osad w skład, którego wchodzą leukocyt,
          5. Do pozostawionego osadu leukocytów dodajemy 300 ml odczynnika "B" (niebieski korek - Tissue and Cell Lysis Solution). Teraz dokładnie mieszamy zawartość przez kilkakrotne przepipetowanie zawartości,
          6. Kolejny krok to dodanie 150 ml odczynnika "C" (zielony korek - MPC Protein, Precipitation Reagent), i mieszamy energicznie przez około 10 sekund,
          7. Wirujemy teraz przez 10 minut przy 12000 obr/min,
          8. Przenosimy supernatant do nowej probówki Eppendorfa,
          9. Do supernatantu dodajemy 500 ml izopropanolu (biały korek), mieszamy zawartość poprzez 30-40 krotne odwracanie probówki Eppendorfa. Już teraz powinna uwidocznić się cienka, poskręcana, biała nić będąca DNA,
          10. Wirujemy zawartość probówki Eppendorfa przez 10 minut przy 12000 rpm,
          11. Teraz na dnie powinna być widoczna biała plamka DNA. Zlewamy supernatant poprzez ostrożne odwrócenie probówki zwracając uwagę by nie naruszyć osadu,
          12. Przepłukujemy osad DNA, dwukrotnie 75 % etanolem znów pamiętając by nie naruszyć osadu. Resztki etanolu usuwamy pipetą,
          13. Do osadu DNA dodajemy 35 ml odczynnika "D" (Eppendorf - TE Buffer),
          14. Probówkę pozostawiamy do rozpuszczenia DNA. Oznaczyć czystość i zawartość DNA w próbce.

Izolacja DNA z krwi zestawem Blond DNA PrepPlus Firmy A&A Biotechnologies

          1. Pobieramy 100 ľl krwi mrożonej do probówki ependorf,
          2. Dodajemy do niej 200 mikrol buforu lizującego LT i 20 mikrol Proteinazy K. Całość mieszamy i inkubujemy przez 20 minut w temperaturze 37°C,
          3. Przenosimy teraz próbkę do 75°C i inkubujemy przez 5 minut,
          4. Próbkę teraz worteksujemy 20 sekund i nanosimy na minikolumnę do czyszczenia genomowego DNA,
          5. Wirujemy 1 minutę przy 12000 rpm,
          6. Wyjmujemy mikrokolumę wraz z probówką i dodać 500 mikrol roztworu płuczącego Al,
          7. Wirujemy 1 minutę przy 12000 rpm,
          8. Dodajemy do kolumny 300 mikrol roztworu Al.,
          9. Wirujemy 1 minutę przy 12000 rpm,
          10. Przenosimy minikolumnę do nowej probówki 1,5 ml i dodajemy do niej 50 mikrol buforu Tris ogrzanego do temperatury 75°C,
          11. Inkubujemy próbkę 5 minut w temperaturze pokojowej,
          12. Wirujemy 1 minutę przy 12000 rpm,
          13. Minikolumnę usuwamy a oczyszczone DNA przekładamy do lodówki

Izolacja DNA genomowego przy pomocy zestawu MasterPure Genomie DNA Purification Kit firmy Epicenter Technologies.

          1. W probówce ependorf umieszczamy 325 mikrol krwi i dodajemy 1 ml Lysis Buffer 1. Wstrząsamy probówką kilka razy, aby całkowicie zawiesić materiał,
          2. Inkubujemy przez 5 minut w temperaturze pokojowej a następnie worteksujemy przez kilka sekund,
          3. Następnie inkubujemy przez kolejne 5 minut i ponownie worteksujemy przez kilka sekund,
          4. Teraz zwirowywujemy leukocyty przez 25 sekund,
          5. Zlewamy supernatant pozostawiając około 25 mikrol płynu. Worteksujemy, aby rozpuścić pozostający osad,
          6. Rozpuszczamy leukocyty w 500 mikrol Lysis Buffer 2 poprzez przepipetowanie komórek 5 do 8 razy,
          7. Dodajemy teraz 200 mikrol Precipitation Solution i worteksujemy intensywnie przez 30 sekund,
          8. Następnie wirujemy przez 10 minut przy 12000rpm,
          9. Przelewamy, supernatant do czystego Eppendorfa i dodajemy 500 ľl alkoholu izopropanolowego. Mieszamy teraz zawartość odwracając próbówkę 30 do 40 razy. Można teraz już zobaczyć precypitat, którym jest DNA,
          10. Zwirowywujemy wytrącone DNA przez 1 minutę przy 12000 rpm,
          11. Ostrożnie zlewamy supernatant uważając, aby nie wylać osadu. Usuwamy resztki etanolu pipetą i suszymy pod wyciągiem, uważając by nie przesuszyć osadu.
          12. Rozpuszczamy DNA w 50 mikrol buforu TE i inkubujemy w temperaturze pokojowej lub rozpuszczamy DNA poprzez szybkie pipetowanie, a następnie worteksowanie przez 10 sekund.

Izolacja DNA z krwi metodą wizard

          1. Do 1,5 ml probówek napipetowujemy po 900 mikrol buforu TE.
          2. Dodajemy teraz po 300 mikrol krwi, i mieszamy oraz wirujemy przez 20 do 30 sekund przy 13000-16000 obrotach na minutę,
          3. Zlewamy teraz roztwór i ponownie dodajemy 900 mikrol TE, mieszać i odwirowujemy,
          4. Czynności te powtarzamy do momentu uzyskania roztworu o jasno-różowym zabarwieniu,
          5. Dodajemy 900 mikrol CLS (Celi Lysis Solution) i mieszamy odwracając 5 do 6 razy aż do wymieszania,
          6. Inkubujemy w temperaturze pokojowej przez około 10 minut odwracając między czasie 2 do 3 razy. Po inkubacji wirujemy przez 20 sekund przy 13000-16000 obr/min,
          7. Usuwamy supernatant tak by nie zmącić widocznego białego peletu. W próbówce powinno pozostać około 50 mikrol płynu,
          8. Pelet bardzo delikatnie rozbijamy na worteksie tak by powstała widoczna biała zawiesina,
          9. Do rozbitego peletu dodajemy 300 mikrol NLS (Nuklei Lysis Solution). Mieszamy pipetując roztwór 5 do 6 razy. Roztwór powinien stać się lepki i ciągnąć się. Inkubujemy roztwór przez 1 godzinę w temperaturze 37°C. Po zakonczniu inkubacji schładzamy probówki do temperatury pokojowej,
          10. Dodajemy 100 mikrol PPS (Protein Precipitation Solution) i mieszamy bardzo dokładnie na worteksie przez 10 do 20 sekund. Powinno otrzymać się roztwór o mlecznobiałym kolorze,
          11. Wirujemy przez 3 minuty w temperaturze pokojowej przy 13000-16000 obr/min. Na dnie probówki powinien być widoczny ciemnobrązowy pelet,
          12. W trakcie wirowania przygotować wysterylizowane 1,5 ml probówki, do których należy napipetować 300 mikrol izopropanolu o temperaturze pokojowej,
          13. Po skończonym wirowaniu przenosimy bardzo dokładnie płyn do wcześniej przygotowanych probówek. Delikatnie mieszamy roztwór przez odwracanie go aż do uzyskania DNA w postaci białego kłaczka, kropeczki,
          14. Wirujemy przez 1minutę w temperaturze pokojowej i zlewamy płyn,
          15. Teraz dodajemy 100 mikrol 70% etanolu o temperaturze pokojowej przemywając DNA i wirujemy przez 1 minutę,
          16. Delikatnie odciągamy pipetą etanol uważając gdyż DNA w postaci peletu może być luźny. Pozostawiamy probówki na 10 minut aż do odparowania resztek alkoholu,
          17. Dodajemy 100 mikrol DNA RS (DNA Rehydratation Solution) i inkubujemy przez 1 godzinę w temperaturze 65°C.

          Każda procedura izolowania DNA powinna zakończyć się oceną uzyskanego preparatu DNA. Oceniając jakość preparatu określamy stopień jego zdegradowanie, który ma kluczowe znaczenie dla dalszej obróbki np. amplifikacji metodą PCR. Ocena taka wykonujemy przy zastosowaniu elektroforezy w żelu agarozowym 1% do 1,5% przy 100V i 0,5 godzinie pracy aparatu. Ocena ilości świadczy o wydajności naszego procesu. Najczęściej do oceny ilości DNA stosowana jest metoda spektrofotometryczna. Aparat do pomiarów spektrofotometrycznych ustawiamy na pomiary przy długości fal 260 i 280 nm. Analizy dokonujemy wobec wody jałowej będącej próbą ślepą. Po odczytaniu wyników pomiarów obliczmy iloraz absorbancji mierzonej właśnie przy A260nm/A280nm. Preparat DNA powinien mieć stężenie około 1mg/1ml. Odpowiada to czystości spektrofotometrycznej przy A260nm/A280nm pomiędzy wartościami 1,6 a 1,8. Wartości poniżej 1,6 świadczą o tym, że preparat jest zanieczyszczony białkami. Jeśli jednak otrzymany wynik jest większy od 1,8 to zanieczyszczenia wynikają z pozostałości odczynników użytych w metodzie. Zawartość DNA w roztworze wyraża się w mikrog/ml i liczy się za pomocą równania;

Zawartość DNA = A260 × 50 × R
50 - 1 jednostka absorbancji = 50 mikrog DNA dwuniciowego
R - rozcięczenie

          Uzyskany preparat nie może zawierać inhibitorów reakcji PCR oraz mieć duża trwałość. Oczyszczony preparat DNA możemy przechowywać w temperaturze pokojowej jednak jak najkrócej, jeśli przechowywany będzie w temperaturze 4°C to czas przechowywania wydłuży nam się do kilku miesięcy. Jeśli dodatkowo dodamy chloroform w ilości 5 mikrolitrów na mililitr DNA to w temperaturze 4°C czas przechowywanie znacznie nam się przedłuży. Również w stanie zamrożenia okres ten stanie się nieokreślony.