Strona
Główna

Badania
Molekularne

Analiza
Statystyczna

Analiza
Informatyczna

Linki
Kontakt

Forum
Dyskusyjne



Podstawy polimerazowej reakcji łańcuchowej PCR (Polymerase Chain Reaction)


          Początkowe problemy, jakie napotykali naukowcy zajmujący się inżynierią genetyczna były związane z trudnościami w uzyskiwaniu odpowiedniej do celów analitycznych ilości DNA. By namnażać z trudem wyizolowane fragmenty DNA, musiano integrować go przy stosowaniu wektorów, które z kolei integrowały się z bakteriami. Dopiero maszyneria komórkowa bakterii namarzała lub nie, badany fragment. Odzyskanie wprowadzonego fragmentu znów nastręczało wiele problemów. Pilnie potrzebna była metoda naśladowania procesu replikacji zachodzącego w komórce w warunkach in vitro. Powstała, więc metoda powielania, czyli amplifikacji DNA metodami laboratoryjnymi.
          Odkrywcami tej metody byli Kary Mullis i Randall Saiki. Mullis sam pisał, że jest ona jedynie prostą kombinacja reakcji znanych niezależnie od siebie od ponad 20 lat. Za jej odkrycie otrzymał on nagrodę Nobla. Badania swe prowadził wraz z Faloonie w 1985 roku na genie kodującym ß-globinę w diagnostyce anemii sierpowatej. Jak to często bywa badacze ci przywrócili do "życia" metodę znaną już wcześniej. Podstawowe zasady reakcji PCR zostały opisane już wcześniej przez Kleppego i Khoranę. Naukowcy ci nie zdali sobie jednak sprawy z możliwości cyklicznego automatycznego przeprowadzenia tej reakcji. Aparatura do PCR jest teraz dostępna jak każde inne podstawowe przyrządy badawcze. Zasada działania PCR jest genialna w swej prostocie.
          Artur Kornberg w 1955 roku odkrył enzym, polimerazę DNA był to pierwsze krok do poznania molekularnych mechanizmów replikacji. Reakcja replikacji katalizowana przez ten biokatalizator, jakim jest polimeraza polega na przyłączaniu wolnych nukleotydów do jednoniciowej struktury łańcucha DNA. Od określonego końca zwanego 3' w kierunku końca 5' do istniejącej nici będącej matrycową dokańczane są na zasadzie komplementarności trójfosforany nukleotydów i po połączeniu z matrycą i wzajemnie ze sobą tworzy się typowa struktura dwuniciowego DNA.
          W założeniu dzięki metodzie PCR powielany jest fragment DNA, który w początkowym etapie znajduje się jedynie w jednej kopii. Selektywność tej metody powinna doprowadzić do sytuacji, że, po okresie amplifikacji fragment DNA, który stanowił na początku mniej niż jedną milionową część z całości DNA, zostaje namnożony selektywnie tak, czego efektem jest wzrost jego zawartości do 98 i więcej procent.
          Podstawową kwestią jest maszyneria enzymatyczna umożliwiająca naśladowanie naturalnej amplifikacji w warunkach in vitro. Wykorzystano tu naturalną właściwość polimerazy DNA, która w sprzyjających okolicznościach naprawia ubytki i syntetyzuje nowe nici na matrycy starych. Wystarczy stworzyć jej dogodne warunki.
          Początkowo reakcję amplifikacji przeprowadzono z zastosowaniem fragmentu Klenowa polimerazy DNA I. Enzym ten otrzymujemy jako produkt proteolizy polimerazy Kornberga subtilizyną lub z rekombinanta E. coli syntetyzującego to białko ze zmienionego genu polA. W budowie jest to pojedynczy polipeptyd o masie 75 kD, mający dwie różne aktywności. Są to; aktywność polimerazy oraz egzonukleazy 3'>5'. Wynikają też stad jego specyficzne właściwości. Jako polimeraza DNA 5'>3' wymaga matrycy jednoniciowego DNA, czyli ssDNA i primera DNA lub RNA z końcem 3'-OH. Jako egzonukleaza 3'>5' degraduje dwuniciowy DNA, czyli dsDNA lub jednoniciowy ssDNA od końca 3'-OH. Zastosowanie znalazł on między innymi przy; wypełnianiu i znakowaniu dwuniciowego DNA z 5'-jednoniciowym lepkim końcem, przy znakowaniu ssDNA metodą wydłużania startera, przy syntezie drugiej nici cDNA, przy syntezie sond ssDNA, przy znakowaniu DNA metodą przesunięcia pęknięć.
          Problematyczne jednak było niezmiernie to, że enzym ten jak każde z białek denaturował w wysokiej temperaturze. Jednak by uzyskiwać matryce do syntezy kolejnych odcinków DNA nieodzowne było denaturowanie cząsteczek dwuniciowego DNA, czyli dsDNA do jednoniciowych struktur ssDNA i to w wysokiej temperaturze, bo około 95°C. Denaturacja DNA wywoływała denaturacje białka, więc po każdym cyklu należało dodać świeżą porcja polimerazy fragmentu Klenowa.
          Rozwiązanie podpowiedziała sama natura. Życie opanowało na ziemi każdy skrawek w tym również gorące źródła. Żyjące tam bakterie w temperaturze musiały między innymi jakoś rozwiązać problem rozmnażania się a co za tym idzie powielania własnego materiału genetycznego. Gdy zwrócono na ten aspekt uwagę był to strzał w dziesiątkę. Enzymy biorące udział w metabolizmie komórek poddanych działaniu wody bliskiej wrzenia były odporne na denaturację w tych warunkach. Za replikacje DNA w tych bakteriach odpowiedzialna była polimeraza termostabilna, czyli enzym nietracący swych właściwości nawet termostabilnej temperaturze denaturacji dla zwykłych białek.
          Wprowadzenie termostabilnej polimerazy Taq, izolowanej z bakterii Thermus aquaticus lub Thermus thermophilus, ogromnie zrewolucjonizowało PCR. Enzymy te nie ulegają inaktywacji w temperaturze denaturacji matrycy DNA, dzięki czemu jednokrotne podanie polimerazy wystarcza na przebieg całej reakcji. Synteza nowych nici DNA może równocześnie przebiegać w temperaturze około 70°C, a nie jak poprzednio 35°C. dzięki temu wszystkie oligonukleotydy niespecyficzne związane z matrycą oddysocjowują. Dzięki temu specyficzność i dokładność wraz z wydajnością znacznie wzrasta.
          Obecnie prócz wspomnianych bakterii producentów Thermus enzymy te otrzymać możemy od rekombinanta innej bakterii, czyli E. coli. Enzym ten w budowie zbliżony i funkcjonalnie podobny do polimerazy DNA I z E.coli. Specyficzna właściwość to; termostabilność w zakresie temperatur od 37°C do 94°C (optimum działania przy 80°C). Jako polimeraza DNA 5'>3' wymagająca do aktywności matrycy ssDNA oraz primera DNA lub RNA z końcem 3'-OH. Jako egzonukleaza 5'>3' degraduje od końca 5'-P dwuniciowy DNA (dsDNA) lub hybryd DNA-RNA. Enzym ten znalazł zastosowanie prócz amplifikacji DNA poprzez łańcuchową reakcję polimeryzacji, również, w sekwencjonowaniu DNA metodą Sangera. Obecnie różne polimerazy termostabilne pojawiły się na rynku. Różnią się one miedzy sobą warunkami, jakich wymagają do przechowywania oraz wydajnością, dokładnością, jak i zdolnością sprawdzania syntetyzowanych fragmentów DNA. Szczególną uwagę należy zwracać na poziom błędu wbudowania niekomplementarnego nukleotydu w nową nić. Może on wynosić od 1/10 000 do 1/100 000 nukleotydów. Jeśli byłby zbyt duży otrzymany produkt PCR różniłby się zbyt znacząco od materiału wyjściowego.
          Więc mamy cząsteczkę lub cząsteczki DNA chcemy poddać ją procesowi amplifikacji. Jednak nie interesuje nas replikacja całej cząsteczki DNA, tylko fragmentu potrzebnego nam do dalszych analiz, i to właśnie ten wybrany przez nas fragment po zakończonej reakcji PCR ma stanowić ponad 99,9% całości uzyskanego DNA. Uzyskujemy to poprzez oskrzydlenie wybranego fragmentu starterami w postaci oligonukleotydów. Te krótkie, jednoniciowe łańcuchy nukleotydowe są tak dobrane by komplementarnie hybrydyzowały z fragmentami DNA na obu niciach matrycowych, przed i za elementem nas interesującym. Są one niezbędne by polimeraza podjęła proces replikacji, jednak by możliwe było połączenie nici matrycowej i starterów temperatura nie może osiągać wartości powyżej 60°C. Reakcja PCR przebiega przy ich nadmiarze by zawsze wszystkie nici DNA stawały się odpowiednimi matrycami dla polimerazy. Są one ściśle komplementarnych do sekwencji leżących po obu jego stronach, inaczej mówi się, że go oskrzydlają. Posłużą do odnalezienia szukanego fragmentu DNA przez polimerazę DNA. Jeśli dysponujemy już takimi syntetycznymi fragmentami dla określonego genu, liczącymi mającymi różną długość od około 20 nukleotydów, możemy zastosować już metodę PCR. Dlaczego 20-cia? Jeżeli mamy do wyboru 4 rodzaje nukleotydów to możemy ułożyć z nich 4 do potęgi n, różnych n-nukleotydowych sekwencji. Dzięki temu 20 nukleotydowy odcinek posiada już niewyobrażalna ilość kombinacji i mało prawdopodobne jest, że wystąpi ona przy innym genie niż ten analizowany. Sprawa nie przedstawia się tu jednak tak prosto. Projektowanie primerów to bardzo skomplikowany proces obarczony wieloma obwarowaniami.
          Już wiemy, że denaturacja DNA wymaga innej temperatury przyłączenie primerów wymaga innej natomiast elongacja jeszcze innej. Tak, więc w procesie PCR następują po sobie cykliczne zmiany temperatur wynikające z cykliczności zachodzących reakcji. Reakcje wchodzące w skład cyklu to; wspomniana denaturacja DNA, hybrydyzacja primerów i elongacja, czyli synteza nici potomnej na matrycowej. Substratami tej reakcji są trójfosforany deoksynukleotydów, dNTP, będące substratami reakcji i dostarczającymi energię do jej przebiegu. Są to dATP, dCTP, dGTP i dTTP. Po skończonym cyklu rozpoczyna się kolejny w celu rozplecenia powstałej struktury dsDNA. Cykle takie powtarzają się wielokrotnie. Teoretycznie po n cyklach otrzymuje się 2 do potęgi n, dwuniciowych cząsteczek DNA, czyli ich ilość wzrasta logarytmicznie. Wszystkie one powinny być wiernymi kopiami sekwencji oskrzydlanej przez primery. Cykli w zasadzie przeprowadza się od 20 - 40. Zatem z jednej matrycy DNA po 20 cyklach uzyskuje się amplifikację rzędu około 1 048 576, a po 30 cyklach rzędu 1 073 741 824.


          Oprócz tego w mieszaninie zawarte są kationy metali Mg i K oraz bufor. Po denaturacji, zachodzącej w temperaturze 95°C. Następuje schładzanie mieszaniny do temperatury, w której startery mogą łatwo i dokładnie hybrydyzować z matrycą jest to z reguły temperatura bliska około 60-65°C. I w tym momencie do pracy przystępuje, polimeraza, ale i jej należy stworzyć optymalna temperaturę w zależności między innymi od wielkości, jaką przewidujemy dla syntetyzowanego odcinka jest ona bliska granicom około 58-72°C.
          Zasadniczym problemem jest projektowanie optymalnych starterów dla amplifikacji. Obecnie do projektowania starterów używa się istniejących do tego celu odpowiednich programów komputerowych lub narządzi on-line w Internecie. Algorytmy te w sposób mniej lub bardziej trafny określają nam dobór starterów. Są jednak prawie niezastąpione w pracy nad PCR. Cały proces poszukiwania optymalnych primerów program przeprowadza automatycznie, jednak człowiek może wystąpić jako czynnik ograniczający precyzując pewne parametry jak na przykład długość starterów, oraz jakie ma być ich położenie, stopień specyficzności i długość otrzymanego w PCR interesującego produktu. W przypadku niepowodzeń w poszukiwaniu można stopniowo zmniejszyć restrykcje wymagań.
          Mogą one przewidywać na podstawie sekwencji nukleotydów czy zaprojektowane startery nie utworzą dimerów lub innych struktur wyższego rzędu, programy badają możliwość powstawania dimerów heterogennych obydwu starterów, dimerów, homogennych pierwszego startera, dimerów homogennych drugiego startera i wreszcie struktur typu szpilki do włosów obydwu starterów. Jest to problem gdyż przyjmowanie przez startery struktur primer-primer, czyli dimerów lub struktury szpilki do włosów może znacznie zakłócić proces amplifikacji poprzez jego zahamowywanie. Kolejne cykle znacząco nie dają tyle produktów ile spodziewaliśmy się z logarytmicznego przewidywania. Dotychczasowe projektowanie starterów metodą tradycyjną praktycznie uniemożliwia tego typu przewidywanie, co przemawia na korzyść komputeryzacji tego procesu.
          Jednym z najważniejszych parametrów niezbędnym do określenia jest zawsze temperatura topnienia Tm, skrót od angielskich słów melting temperature, zaprojektowanej struktury. Przewidywanie to również można zkomputeryzować. Jeśli temperatura topnienia będzie wyższa niż temperatura hybrydyzacji to nic z reakcji nie będzie gdyż do hybrydyzacji nie zajdzie a to warunek rozpoczęcia pracy przez polimerazę. Jeśli zaś Tm jest niższe niż temperatura hybrydyzacji, to tak zaprojektowana struktura w zasadzie nie powinna zakłócić prawidłowego przebiegu reakcji PCR. Temperatura hybrydyzacji (ang. annealing) zależy głównie od budowy, czyli składu, nukleotydowego primerów. Im więcej jest w primerze nukleotydów G i C w stosunku do A i T, tym jest ona wyższa. Wynika to z nieidentycznej liczby wiązań wodorowych pomiędzy parami komplementarnych zasad. Pomiędzy G i C mamy ich trzy, natomiast pomiędzy A i T jedynie dwie. Oczywiście wpływ na temperaturę hybrydyzacji ma również długość startera oraz skład całej mieszaniny reakcyjnej.
          Najprostszym modelem do obliczania temperatury topnienia jest formuła;


          Inny jeszcze w miarę prosty model w celu określania tej temperatury jest wzór;


G - liczba nukleotydów guanylowych
C - liczba nukleotydów cytydylowych
L - łączna liczba nukleotydów

          Niestety, okazuje się czasami, że rzeczywista temperatura hybrydyzacji różni się od wyliczonej, o kilka czy kilkanaście stopni. Musimy w ustalać temperaturę hybrydyzacji doświadczalnie, przy użyciu termocyklera z termogradientowym blokiem grzewczym.
          Więcej równań i teorii; http://www.basic.nwu.edu/biotools/oligocalc.html
          Wygodny oligokalkulator; http://mbcf.dfci.harvard.edu/docs/oligocalc.html
          Przy projektowaniu starterów warto zwrócić uwagę na zawartość par A i T oraz G i C, których powinno być po 50%. Warto także zwrócić uwagę, na zakończenie, primerów aby były to "miękkie" nukleotydy, czyli A lub T, a nie "twarde" jak G lub C. Wiąże się to znów z ilości wiązań wodorowych pomiędzy zasadami azotowymi nukleotydów. W parze A-T jest ich dwa natomiast w parze G-C wiązanie wodorowe jest potrójne. Musimy jeszcze sprawdzić czy końcowe trzy lub więcej nukleotydy każdego z primerów nie są komplementarne sekwencji drugiego primera.
          Kolejny problem to opracowanie warunków jak najbardziej zbliżonych do optymalnych jak to tylko możliwe. Już programy komputerowe projektując startery podają pewne parametry a inne biorą pod uwagę. Analiza temperatury topnienia starterów i daje, więc optymalną oraz najwyższą możliwą temperaturę hybrydyzacji, uwzględniając określone stężeniu starterów oraz zawartość soli MgCI2 i KCl. Obliczona temperatura topnienia służy do określania czasu i temperatury denaturacji.


Warianty metody PCR


          Prosta zasada działania PCR nie ogranicza tej reakcji jako metody badawczej, wręcz przeciwnie do dziś znane jest już wiele wariantów będących modyfikacjami wyjściowego mechanizmu. Metoda PCR dała początek kilku innym metodom, wariantom PCR. Możliwe jest miedzy amplifikowanie nie tylko znanych już sekwencji, lecz wręcz sekwencji bliżej niepoznanych.
          Istnieje na przykład odwrócony PCR, czyli inwerted PCR, w której badany fragment o nieznanej sekwencji nukleotydowej hybrydyzuje z fragmentem znanym, a startery zaprojektowane są jako specyficzne dla znanego odcinka DNA.
          Wewnętrzny PCR czyli nested PCR, to metoda, w której stosujemy dwie pary starterów. Amplifikacja wtedy jest dwuetapowa. Pierwszy etap to amplifikacja z zastosowaniem pierwszej pary starterów o ułożeniu bardziej zewnętrznym. Po skończonym procesie zachodzi reamplifikacja produktu przy zastosowaniu starterów drugiej pary, która ma położenie bardziej wewnętrzne. Dzięki kolejnym po sobie amplifikacjom można uzyskać znacznie podwyższoną specyficzność a przez to czułość.
          Materiałem analizowanym może być również RNA. Mówimy wtedy o RT-PCR od angielskich słów Reverse Transcriptase). W tym wariancie stosuje się dwa enzymy. Pierwszy to typowa polimeraza, drugi to enzym zwany odwrotną transkryptazą. Enzym ten występuje naturalnie u wirusów RNA. Otrzymujemy go na dużą skale z kurcząt zainfekowanych wirusem AMV skrót od angielskich słów Avian Myeloblastosis Virus lub po rekombinacji z komórek E. coli klonowanym genem AMV pol. Budowa tego enzymu to białko dimeryczne, które złożone z podjednostek o masach cząsteczkowych od 62 do 94 kD. Właściwości tego enzymu to; polimeraza 5'>3' wymagająca do aktywności matrycy ssDNA lub, ssRNA oraz primera DNA lub RNA z końcem 3'-OH, kolejna aktywność to egzonukleaza 5'>3' i 3'>5' specyficzna dla RNA w hybrydzie DNA-RNA. Trzecia aktywność to aktywność DNA endonukleazy. Inne zastosowanie tego enzymu to synteza pierwszej nici cDNA, w sekwencjonowaniu, RNA, w sekwencjonowaniu DNA, oraz w znakowaniu 3' końcowych fragmentów DNA. Metoda ta prócz badań nad wirusowym genomem wypiera powoli wcześniej stosowaną technikę badana transkryptów, czyli Northern blotting.
          Można amplifikować równocześnie kilka odcinków DNA przy zastosowaniu kilku par starterów w jednej mieszaninie reakcyjnej. Mówimy wtedy o multipleks PCR.
          Inne próby dotyczą koamplifikacji nieznanej matrycy jednocześnie z matrycą o znanym stężeniu. Dzięki temu uzyskać mamy prócz wyników jakościowych również ilościowe.
          Jeszcze innym ulepszeniem metody PCR jest zastosowanie w mieszaninie reakcyjnej UTP zamiast stosowanego TTP. Dzięki tej modyfikacji możliwe stało się zastosowanie kolejnego enzymu, czyli N-glikozylazy, uracylowej na matrycowy DNA w celu usunięcia ewentualnych amplikonów zanieczyszczających matrycowy DNA. Enzym ten działa jedynie na DNA zawierający uracyl i może być po zrobieniu już tego, co do niej należało łatwo inaktywowana po przez ogrzewanie we wstępnym, denaturującym etapie PCR.
          PCR może być stosowane również in situ, gdy nie używamy wyizolowanego materiału genetycznego, lecz namnażał się ten obecny w komórce i dopiero uwidacznia powstały produkt na przykład dzięki hybrydyzacji in situ.