Strona
Główna

Badania
Molekularne

Analiza
Statystyczna

Analiza
Informatyczna

Linki
Kontakt

Forum
Dyskusyjne



Kontrola pochodzenia zwierząt


          Jednym z głównych zastosowań genetyki molekularnej w hodowli jest sprawdzanie wzajemnych relacji krewniaczych pomiędzy hodowanymi osobnikami. Tradycyjnie rodowody są tworzone przez hodowców poprzez wypełnianie odpowiednich dokumentów hodowlanych oraz dokładne oznakowywanie zwierząt. Zdarzają się jednak pomyłki lub oszustwa. By dokładnie zweryfikować rodowód można zastosować odpowiednie techniki molekularne.
          Rodowód jest to usystematyzowany sposób zapisu przodków każdego osobnika. Osobnik taki zwany probantem w rodowodzie takim ma zapisanych swoich rodziców, dziadków, pradziadków, itd. Zależy to od tego ile informacji zdołano o nim zgromadzić. Jeśli znane jest pochodzenie probantka aż do pięciu pokoleń wstecz to mamy doczynienia z głębokim rodowodem w zupełności satysfakcjonującym hodowców, jeśli znani są wszyscy przodkowie i ewentualnie ich wydajności w wypadku zwierząt produkcyjnych. Informacje uzyskane z rodowodu są podstawą planowej pracy hodowlanej. Dzięki rodowodom unikamy kojarzeń w zbyt bliskim pokrewieństwie, przewidujemy genetyczny potencjał probanta, planujemy różne metody hodowlane jak na przykład hodowle na linie. Rodowód posłużyć również może do ustalenia wartości rynkowej probantka, i właśnie chęć zysku może być źródłem manipulacji rodowodami. Pamiętać jednak należy, że od poprawności prowadzenia rodowodów zależy powodzenie programów hodowlanych. Innymi słowy zysk dla osób sprzedających zwierzęta z fałszywym rodowodem, przynieść może ogromne straty dla całej hodowli tego gatunku. Badania pokrewieństwa mogą również służyć jako dowód w wypadku kradzieży cennych zwierząt.
          Prócz celowych zmian w rodowodzie, pomyłki mogą powstać podczas zabiegów inseminacji, gdy do rodowodu wpisujemy ojca, czyli samca, od którego pobrano nasienie. Jeśli inseminator ma przy sobie nasienie kilku osobników, nie trudno o pomyłkę przy odrobinie nieuwagi. Pomyłki z winy hodowcy mogą powstać, jeśli zwierzęta odpowiednio wcześnie nie zostaną prawidłowo oznakowane. Oczywiście realia są takie, że pewne pomyłki będą się zdarzały i jest to zrozumiałe. Granica niezgodności zapisów rodowodowych z kontrolami molekularnymi morze wynosić 10%, powyżej taj granicy winą obarcza się hodowcę. W hodowli owiec w ostatnich latach procent ten wynosi średnio 5%, w hodowli bydła jest on około dwa razy wyższy.
          Kontrola pochodzenia zwierząt prowadzona jest od wielu lat. Dotychczas w procesie tym wykorzystywano najczęściej układy grupowe krwi oraz inne markery klasy I. Wszyscy zresztą na lekcjach biologii, gdy omawiane są zagadnienia elementarnej genetyki uczymy się o wykluczaniu pokrewieństwa na podstawie ludzkich grup krwi przydatność układzie AB0. Podręczniki czy zbiory zadań z genetyki pełne są pytań nawiązujących do tego tematu. Na podobnej zasadzie odbywa się to w kontroli pochodzenia zwierząt. Różnica to większa ilość dostępnych układów grup krwi oraz ich zwiększony polimorfizm. Skupimy się tu jednak na kontroli pochodzenia i powiązaniach krewniaczych na podstawie sekwencji mini i mikrosatelitarnych.
          Pobieramy, więc standardowy materiał do analiz w postaci krwi bądź nasienia w przypadku samców czy innego produktu biologicznego. Ekstrahujemy z niego kwas nukleinowy i poddajemy go dalszej obróbce.
          Pozyskane od badanych zwierząt DNA cięte jest na mniejsze odcinki. Nożyczkami tnącymi DNA są w genetyce molekularnej, enzymy restrykcyjne, które to odnajdują specyficznie dla siebie sekwencje nukleotydowe i tną nić DNA. Cięcie to nosi nazwę trawienia. Badany materiał genetyczny jest teraz w formie stosunkowo krótkich odcinków zwanych fragmentami restrykcyjnymi.
          Właśnie takie "poćwiartowane" DNA poddajemy procesowi rozdziału elektroforetycznego. Jak wiemy elektroforeza ujawnia nam badany materiał w postaci prążków. Po typowym procesie elektroforezy nadchodzi czas na blotting. Teraz DNA jest przenoszone na folie nitrocelulozową gdzie może hybrydyzować z sonda molekularną. Sonda tą jest np. sekwencja minisatelitarna. Można teraz wywołać obraz bądź to przy pomocy autoradiografii bądź to metodami chemicznymi. W przypadku tej procedury prążków tych jest stosunkowo wiele i czasem przypominają popularne kody paskowe ułatwiające identyfikacje produktów w sklepowych kasach.
          Dalsza procedura przypomina tą przydatność porównywaniem alleli grup krwi. Każdy potomek uzyskuje od każdego przydatność rodziców po jednej sekwencji, czyli po jednym prążku dla każdego loci. Tak, więc potomek ma dwa prążki dla każdego locus. Jeden pochodzi od ojca, więc jest identyczny z którymś ojcowskim, drugi prążek musi być natomiast identyczny z którymś z prążków matczynych.
          Ogromna przydatność sond minisatelitarnych do kontroli pochodzenia wynika z faktu, że prawdopodobieństwo wystąpienia tego same go układu prążków u dwóch losowo wybranych niespokrewnionych osobników jest znikomo małe. Możliwa jest równoczesna analiza na podstawie większej ilości sond, co zwiększa prawdopodobieństwo prawidłowego przyporządkowania krewnych. Oczywiście należy pamiętać o tym ze, uzyskanie porównywalnego względem siebie prążkowania wymaga użycia identycznych enzymów restrykcyjnych oraz tych samych sond molekularnych do każdej próbki, która ma być względem siebie porównywana.
          Jak zawsze tak i tu wykluczenie czy potwierdzenie pokrewieństwa odbywa się tylko z pewnym prawdopodobieństwem. Prawdopodobieństwo to zależne jest od ilości analizowanych loci oraz od tego czy analizy genetyczne dotyczą obu rodziców czy tylko jednego. W przypadku, gdy poddawany analizie jest tylko jeden locus minisatelitarny oraz charakteryzowanego genetycznie prócz potomka mamy tylko jednego rodzica, to prawdopodobieństwo poprawnego wykluczenia obliczamy ze wzoru;




          Gdy dla tego poddanego analizie jednego locus minisatelitarnego znamy genotypy charakteryzowanego potomka oraz obu potencjalnych rodziców, to prawdopodobieństwo poprawnego wykluczenia obliczamy ze wzoru;




          Dla obu z tych wzorów pi oraz pj to częstości i-tego oraz j-tego allelu w locus. Wynika z tego, że nadal w genetyce operujemy tak podstawowymi pojęciami z tradycyjnej genetyki populacji jak częstości, czyli frekwencje genów. Wspomniano już ze prawdopodobieństwo poprawnego wykluczenia wzrasta wraz ze wzrostem ilości rozpatrywanych loci. W przypadku, gdy badaniami objęto większą ilość sekwencji minisatelitarnych, prawdopodobieństwo poprawnego wykluczenia obliczamy po wcześniejszym określeniu PE dla każdego loci oddzielnie. Wzór ten ma następującą postać dla n loci;



          Kontroli takiej poddawano populacje bydła i małych przeżuwaczy, koni, psów i innych zwierząt. Przesłanki przemawiające za taką kontrolą są różne, ale zawsze spowodowane są przez czynnik finansowy.
          Oczywiście metoda ta daje lepsze rezultaty przy dużej heterozygotyczności populacji. I tak u bydła prawdopodobieństwo wykluczenia "nieprawidłowego" rodzica jest równe 99%, gdy zastosuje się już tylko 6 sekwencji mikrosatelitarnych. Oszacowane prawdopodobieństwo to na podstawie polimorfizmu 6 mikrosatelitarnych loci u koni czystej krwi arabskiej wynosiło 77,8%, gdy znany był genotyp jednego z rodziców, natomiast 94,1%, gdy znane były genotypy obojga rodziców. U koni pełnej krwi angielskiej na podstawie polimorfizmu 7 mikrosatelitarnych loci wyniosło ono 75,1% przy znajomości genotypu jednego z rodziców oraz 93,2% przy znajomości genotypów obojga rodziców.
          Prócz wykorzystania sekwencji mini i mikrosatelitarnych planuje się do kontroli pochodzenia wykorzystywać również polimorfizm pojedynczych nukleotydów SNP, czyli single nukleotide polymorphism. Polimorfizm taki to skutek mutacji to znaczy zamiany pojedynczych nukleotydów, czyli mutacji punktowych. Bardzo durzą zaletą tej metody jest to, że mutacje takie są bardzo powszechne w genomie.

          Allel 1.
          ...CAATCTGCA...

          Allel 2.
          ...CAATGTGCA...

          Jak łatwo się domyśleć mutacje alleli SNP mogą być wykrywane techniką RFLP, jeśli tylko spowodują powstanie miejsca rozpoznawanego przez enzymy restrykcyjne.
          Podobne podstawy ma inny rodzaj polimorfizmu, czyli InDel od angielskich słów Insertion Deletion Polimorphism. Jak już nie trudno się domyśleć, w przypadku tego polimorfizmu chodzi o ubytek lub wstawienie jednego lub kilku nukleotydów. Jest polimorfizm na poziomie podobnym do SNP, gdyż również polega na mutacyjnych zmianach.

          Allel 1. - wyjściowy
          ...CAATCTGCA...

          Allel 2. - insercja
          ...CAATATGCTGCA...

          Allel 3. - delecja
          ...CCTGCA...