Strona
Główna

Badania
Molekularne

Analiza
Statystyczna

Analiza
Informatyczna

Linki
Kontakt

Forum
Dyskusyjne



Hybrydyzacja kwasów nukleinowych


          Jeśli jeszcze nie mamy oczyszczonego preparatu DNA lub RNA to przed rozpoczęciem hybrydyzacji musimy dokonać izolacji. W przypadku, gdy materiałem badanym nie jest tkanka płynna tak jak np. krew, to musimy rozdrobnić taką tkankę. Homogenizujemy, więc tkankę, z której chcemy uzyskać materiał do analizy, czyli rozcieramy ją na jednolitą masę. Teraz poddajemy ją procesowi niszczenia i destabilizowania błon komórkowych, oczyszczania przez wirowanie i wytrącanie lub dodatkowe trawienie. Dokładniejsze informacje o ekstrakcji DNA znajdują się w innych działach, np. w pierwszym i ostatnim.
          Niezmiernie ważne jest tu zachowanie ostrożności by nie zanieczyścić próbki, nukleazami które zdegradują, czyli porozcinają nam interesujące nas cząsteczki kwasów nukleinowych. Nukleazy są jednak bardzo powszechne szczególnie te, które degradują RNA. Wszystkie komórki rybonukleazy gdyż enzymy te biorą udział w przeróżnych procesach związanych przemianami metabolicznymi RNA. Procesów takich w komórkach jest sporo a więc i ciągła mobilność RNA w strukturach komórkowych wywołuje, że komórki posiadają durzy potencjał usuwania zbędnego już RNA. Musimy się, więc przed tym ochronić. Robimy to za pomocą czynników dezaktywujących nukleazy. Jest nim najczęściej, DEPC czyli dietylopirowęglan.
          Może on być dodawany odczynników oraz myje się nim szkło i sprzęt, którym posługujemy się przy badaniu. Dzięki temu zapobiegamy niszczeniu kwasów nukleinowych przez nukleazy egzogenne, które możemy przenosić też rękoma. Pamiętamy jednak, że enzymy te znajdują się również wewnątrz komórek i przed nimi też musimy ochronić materiał przeznaczony do badań. Robimy to np. poprzez inkubację obróbki, z proteinazą K, lub traktowanie jej tiocyjanianem guanidyny, która denaturuje białka. Można też dodać związku takiego jak, merkaptoetanol, który redukuje mostki dwusiarczkowe chroni się badany materiał przed RNazami endogennymi.
          Detekcja poszukiwanego DNA odbywać się może za pomocą metody Southern blotting, natomiast w przypadku RNA analogiczna metodą jest Northern blotting. Metody te oparte są na podstawowej zdolności kwasów nukleinowych do tworzenia komplementarnych wiązań pomiędzy sobą. Stosowane sondy są zdolne do wybiórczego wiązania się z sekwencjami do nich komplementarnych. Hybrydyzacja pozwala specyficznie wykrywać interesujące nas sekwencje mimo obecności dużej ilości innych nie komplementarnych molekuł. Komplementarność jest w tym przypadku jako zależnym od sekwencji rozpoznawaniu się molekuł i ich wzajemne wiązanie. To tak jak w naturalnej dwuniciowej cząsteczce DNA, gdy dwie nici wiążą się ze sobą, ponieważ mają komplementarne sekwencje. Dzięki wiązaniu sondy z komplementarną do niej sekwencją powstają kompleksy "sonda-sekwencja komplementarna". Te kompleksy wykrywamy dzięki temu, że sonda jest wcześniej przezornie wyznakowana, radioaktywnie lub chemicznie.
          Zjawisko hybrydyzacji umożliwia tworzenie następujących kompleksów różnych molekuł zwanych inaczej hybrydami. DNA-DNA, gdy jednoniciowe DNA (ssDNA) może dzięki parowaniu zasad tworzyć dwuniciowe hybrydy, w których ssDNA sondy wiąże się do komplementarnego ssDNA analizowanej sekwencji. DNA-RNA, gdy sonda, którą jest ssDNA może tworzyć dwuniciowe hybrydy z komplementarna cząsteczką, RNA, która jest z reguły jednoniciowa. Trzeci i ostatni rodzaj hybryd to RNA-RNA. Z hybrydyzacją sond wiążą się dwa pojęcia. Reakcja hybrydyzacji jest specyficzna, co oznacza, że sonda wiąże się tylko do sekwencji komplementarnej. Hybrydyzacja jest wybiórcza, czyli zachodzi pomiędzy komplementarnymi molekułami RNA mimo obecności dużej ilości molekuł nie komplementarnych. Tak, więc sonda może wiązać się wybiórczo do obiektu docelowego w roztworze bilionów spokrewnionych, lecz nie identycznych molekuł.
          Techniki hybrydyzacji są, nieocenione, ponieważ w komórce znajduje się tysiące genów i tysiące różnych mRNA. Jeśli teraz uwolnimy kwasy nukleinowe z komórki podczas ekstrakcji to całe DNA i RNA znajduje się specyficznego próbce. Analiza specyficznego genu lub jego produktu, czyli mRNA w takiej mieszaninie nie byłaby możliwa, jeśli nie potrafilibyśmy wykrywać konkretnej molekuły RNA lub DNA. Również najnowsze badania DNA przy zastosowaniu, mikromacierzy opierają swą zasadę o zjawisko specyficznej hybrydyzacji.
          Wydawać by się mogło, że wystarczy dodać do badanej próbki DNA wyznakowaną np. radioaktywnie sondę i otrzymamy wyniki po specyficznej hybrydyzacji. Jednak tu pojawia się problem gdyż po zmieszaniu roztworu analizowanego z radioaktywna sondą otrzymamy radioaktywną mieszaninę. Więc nie można określić, w których miejscach utworzyły się hybrydy. Dlatego też proces hybrydyzacji musi być poprzedzony rozdzieleniem mieszaniny DNA na oddzielne fragmenty. Odbywa się to w procesie elektroforezy w żelu. Kwasy nukleinowe musza być do tego procesu odpowiednio przygotowane by później odpowiednio reagować w procesie hybrydyzacji. Stosujemy, więc różne techniki przy usuwaniu struktur drugorzędowych i trzeciorzędowych RNA i DNA. Podczas przygotowywanie DNA do metody Southerna tnie się go enzymem restrykcyjnym na fragmenty restrykcyjne, które mają jedynie strukturę pierwszorzędową. Natomiast RNA do metody Northerna również wymaga denaturacji w obecności formaldehydu, inne środki to, glyoxal/DMSO lub silnie trujący, methylmercuric chloride. I choć RNA jest jednoniciowe to jednak poprzez występowanie komplementarnych zasad mogą tworzyć się struktury drugorzędowe. W praktyce zwykle mniej niż 50% cząsteczki RNA pozostaje, jednoniciowa co stanowi bardzo dużym odstępstwie od struktury jednoniciowej. Teraz dopiero pozbawione struktur drugorzędowych próbki mogą zostać rozdzielone pod względem masy cząsteczkowej. Nie mają już struktur drugorzędowych i trzeciorzędowych a więc ich wędrówka przez pory w żelu jest proporcjonalna do ich masy cząsteczkowej. Pamiętać, więc należy, że w metodzie Southerna, DNA w żelu jest nadal dwuniciowe, tak, więc trzeba go będzie jeszcze denaturować przed hybrydyzacją, gdyż sonda wiąże się tylko do jednoniciowych struktur. Natomiast, RNA już w czasie elektroforezy znajduje się w postaci jednoniciowej, co bez dodatkowych zabiegów denaturacji umożliwia wiązanie się sondy.
          Pierwszy etap pracy z metodami hybrydyzacji fragmentów rozdzielonych na żelu to przygotowanie tego żelu. Żel przygotowujemy rozpuszczając agarozę w wodzie wolnej od nukleaz. Najczęściej przydatna staje się tu domowa kuchenka mikrofalowa. Mieszaninę mieszamy, co kilkadziesiąt sekund nie dopuszczając do całkowitego wrzenia. Oprócz rozpuszenia całej, agarozy musimy zwracać uwagę na odpowietrzenie roztworu. Po rozpuszczeniu agarozy pozostawiamy ją na kilka minut w temperaturze bliskiej 100°C. Do takiego roztworu dodajemy uprzednio ogrzany bufor, by różnica temperatury nie spowodowała miejscowego schłodzenia żelu. Teraz czekamy na przestygniecie żelu do około 50°C, po czym dodajemy formalinę, czyli 37% formaldehyd w przypadku RNA. Tak przygotowany żel jest gotowy do wylania na wanienkę elektroforetyczną, gdzie będzie tężał. Warstwa żelu nie może być zbyt gruba by umożliwić późniejsze etapy transferu kwasów nukleinowych z żelu na filtry.
          Przeprowadzamy teraz proces elektroforezy. Do uformowanych w żelu kieszonek napipetowujemy próbki do analiz wraz z bromkiem etydyny. Elektroforezę w tym przypadku przeprowadzamy przy niskim napięciu np. 18 godzin 5-20V. Przy tak długim procesie bufor wymaga mieszania, co kilka godzin i najlepiej, jeśli całość będzie prowadzona w warunkach chłodnych. Uzyskać to można na przykład poprzez trzymanie zestawu w kuwecie z lodem. Elektroforezę taką prowadzimy do czasu, aż barwnik bromophenol blue osiągnie 1/2 do 2/3 długości naszego żelu. Teraz żel taki może być oglądany pod transiluminatorem UV gdzie zobaczyć możemy pozycje naszych próbek poprzez świecenie się bromku etydyny.
          Kolejny etap to immobilizacja, czyli unieruchomienie, co jest niezbędne podczas hybrydyzacji. Chcąc po procesie elektroforezy przeprowadzić hybrydyzację musimy DNA lub RNA przenieść z żelu na membranę nylonową lub filtry nitrocelulozowe. Hybrydyzacja przeprowadzona w żelu nie dają zadawalających wyników ze względu na obecność utrudnień w mobilności kwasów nukleinowych w porach żelowych. Zjawisko to będące podstawą procesu elektroforezy nie pozwala na prawidłową hybrydyzacja. To właśnie ten proces przenoszenia i unieruchamiania kwasów nukleinowych nazywa się blotowaniem. Stąd tez nazwy Northern blot lub Southern blot. DNA i RNA przenosi się na membranę najczęściej poprzez transfer kapilarny, polega to na przemieszczaniu się wraz z strumieniem buforu przepływającego przez żel.
          Transfer taki, czyli "downwoard" przeprowadza się w odpowiednio wysokiej plastikowej wanience. Wanienka ta zawierać będzie bufor i dla tego na jej dnie kładziemy grubą warstwę bibuły lub plastikowy podkład by podwyższyć poziom, na którym będzie znajdował się cały transfer, co zapobiegnie jego zatopieniu. Teraz możemy wyłożyć kawałki zwilżonego buforem papieru Whatmana. Kawałki te powinny być znacznie większe od powierzchni żelu, z którego odzyskiwać będziemy materiał genetyczny. Na tę warstwę możemy położyć filtr, który powinien być większy od żelu, ale już niewiele. Na filtr nylonowy nakładamy żel, pamiętając by był on w takim położeniu, w jakim był wyciągnięty z aparatu do elektroforezy. Ważne jest by teraz zaznaczyć w jakiś sposób orientacje filtra i żelu w celu dokładnej i jednoznacznej interpretacji wyników. Dokładne ścisłe zetknięcie się filtra i żelu jest możliwe dzięki lekkiemu polaniu filtra rozcieńczonym buforem i dopiero nakładanie żelu. Teraz możemy przebić studzienki żelu i jednocześnie zaznaczając ich położenie na filtrze. Analogiczne warstwy papieru jak pod zestawem filtr-żel nakładamy na niego od góry. Te kolejne warstwy papieru Whatmana, powinny tym razem być dokładnie tej samej wielkości, co żel. Dokładamy na to jeszcze więcej kolejnych warstwy papieru. Te kolejne warstwy powinny mieć nadal szerokość żelu jednak tym razem powinny być o wiele dłuższe. Ich długość powinna pozwalać na zanurzenie końców w wanience z rozcieńczonym buforem SSC. Na całości transferu kładziemy mniejszą wanienkę z buforem i w niej zanurzamy długie końce papieru Whatmana. Jeśli dopilnujemy by nie zabrakło buforu to taki transfer trwa około 1-3 godziny w warunkach chłodniczych. Czas ten jest zróżnicowany i zależy od grubości i stężenia użytego żelu oraz od wielkości analizowanych fragmentów.
          Po skończonym transferze na powierzchnie filtra, możemy przystąpić do dalszej obróbki. Filtr po procesie transferu poddany musi zostać poddany immobilizacji przed procesem prehybrydyzacji. Odbywa się to poprzez 5 minutowe naświetlanie transiluminatorem i późniejsze osuszenie na powietrzu, przy czym papier lub bibułą pomogą przy odciąganiu wilgoci. Gdy filtr wyschnie owijamy go papierem i zapiekamy w 80°C przez około niecałą 1 godzinę.
          Dodanie teraz sondy spowoduje, że hybrydyzuje ona z badanymi próbkami oraz zwiążę się z cała powierzchnią filtra. Analizowanie takiego filtra wykazałoby, że cały jest pokryty radioaktywną sekwencją. Żeby temu zapobiec musimy zablokować, czyli wyłączyć wszystkie wolne miejsca na powierzchni filtra proces ten nazywamy prehybrydyzacją. Dokonujemy tego w ten sposób, że pozwalamy by cały filtr związał DNA lub RNA. Inkubuje się, więc go w roztworze zawierającym stężony DNA lub RNA. Prehybrydyzacją ta odbywa się w temperaturze około 45°C, przez czas około 5 godzin. Cała jego powierzchnia zostaje wtedy pokryta związanymi makromolekułami i nie może już więcej związać żadnej cząsteczki. Użyty roztwór, prehybrydyzacyjny ma taki sam skład jak hybrydyzacyjny z wyjątkiem braku sondy. W ten sposób filtr został nasycony i zablokowany.
          Możemy teraz przystąpić do zastosowania sondy. Sondy znakowane są najczęściej radioaktywnie. Przygotowanie takiej sondy polega na odzyskaniu przy pomocy trawienia z wektora molekularnego najczęściej plazmidu interesującej nas sekwencji. Fragmenty restrykcyjne, czyli matryce z wektora są następnie znakowane z użyciem losowych heksametrów. Znakowanie odbywa się poprzez syntezę nowych nici badanej poszukiwanej sekwencji na matrycy sekwencji z wektora. Denaturowane termicznie matrycowe DNA mieszamy z mieszanina losowych heksamerów, czyli fragmenty ssDNA o długości sześciu nukleotydów. Sekwencje te to wszystkie kombinacje, jakie mogą powstać z sześciu nukleotydów. Heksamery te parują ze wszystkimi komplementarnymi miejscami, jakie odnajdą na matrycy. Teraz możemy pozwolić by DNA polimeraza DNA rozpoczęła syntezę nowych nici przy pomocy cegiełek, dATP, dGTP, dTTP, dCTP niektóre radioaktywnego nich mogą być źródłem radioaktywnego pierwiastka. Radioaktywnym elementem jest tu zazwyczaj radioaktywny izotop fosforu, 32P związany z cukrem. Emituje on promieniowanie ß o energii E =1,71 MeV (megawoltów). Inny pierwiastek to 35S promieniujący falami ß o energii E =0,167 MeV, lub tryt 3H o sile promieniowania ß, E =0,018 MeV. Ważną informacją jest również okres półtrwania tych izotopów; 14,3 dnia dla 32P, 87,1 dnia dla 35S oraz 12,26 roku dla 3H.
          Sondę, którą odszywaliśmy musimy jeszcze oczyścić, aby pozbyć się niewłączonego do DNA izotopu oraz by usunąć zbyt krótkie radioaktywnych fragmentów. Zanieczyszczenia te mogłyby wiązać się w sposób niespecyficzny do membrany, co zafałszowałoby wyniki obserwacji. Teraz tuz przed hybrydyzacją ponownie mieszaninę poddajemy działaniu denaturującej temperatury gotując oraz mieszamy z buforem.
          Przystępujemy do właściwej hybrydyzacji. Dodajemy roztwór sondy wszystkich buforze do filtra wszystkich inkubujemy kilka godzin by dać czas wszystkim sondom odnaleźć swoje komplementarne sekwencje. Kinetyka tego procesu polega na wielokrotnym procesie asocjacji i dysocjacji. Związane jest to z temperatura topnienia, czyli takim punktem, w którym 50% długości sekwencji DNA jest rozpleciona. Hybrydyzacje przeprowadza się zazwyczaj w temperaturze bliskiej 68°C a więc wyższej od Tm o jakieś 20°C - 25°C.
          Część sond nie odnajduje już wolnych sekwencji komplementarnych i nie wiąże się w strukturę hybryd. Jednak nadal znajduje się na filtrze, choć w formie niezwiązanej ani z kwasami nukleinowymi ani z filtrem. Możemy, więc niezwiązane sondy wypłukać przemywając filtr kilkakrotnie odpowiednimi buforami. Zabieg ten wydawać by się mogło mało skomplikowany może również mieć znaczenie analityczne. Wynika to z różnej ostrości płukania. Sondy, które odnalazły komplementarną sekwencje w 100% trzymają się jej najmocniej, jednak istnieją też takie, które związane są z badanym materiałem tylko w 90% czy 75% lub innych w zależności od stopnia homologii. Kontrolując siłę płukania możemy kontrolować specyficzność, która jest nam potrzebna w naszych badaniach. Na przykład, gdy poszukujemy analogicznych sekwencji u różnych gatunków nie zależy nam by były one identyczne w 100% o stopniu podobieństwa zadecydujemy później na razie szukamy jedynie podobnych odcinków. Ostrość płukania będzie wtedy mniejsza. To samo w przypadku mutacji.
          Po płukaniu mamy już tylko filtr z miejscami, w których sonda znalazła i związała się z komplementarnymi sekwencjami. By teraz takie miejsca ujawnić dla naszego narządu detekcji, czyli oka trzeba zastosować metody umożliwiające zmianę charakteru tego znacznika. Metodą to w przypadku promieniowania jest autoradiografia przy zastosowaniu kliszy rentgenowskiej. Przykładając filtr i kliszą do siebie powodujemy, że promienie niewidzialne dla nas oddziałują na czarna klisze wywołując rozjaśnienie w punktach gdzie znajduje się radioaktywna sonda a więc poszukiwana homologiczna sekwencja. Wywołanie takiej kliszy daje odwrócenie barw miejsca naświetlone przez promieniowanie to ciemne punkty na jasnym tle. Znając rozkład tych plam znamy rozkład DNA lub RNA na filtrze a to z kolei daje nam informacje o rozkładzie kwasów nukleinowych w żelu. Możemy jeszcze teraz odnaleźć takie miejsca i odzyskać z nich materiał o interesującej nas sekwencji do innych analiz.