Strona
Główna

Badania
Molekularne

Analiza
Statystyczna

Analiza
Informatyczna

Linki
Kontakt

Forum
Dyskusyjne



Enzymy restrykcyjne jako molekularne narzędzia do przeprowadzania badań.


          Odkrycie możliwości enzymów restrykcyjnych pozwoliło na nowa jakość badaniach genetyki molekularnej. Wszystkie enzymy to składowe systemu restrykcji-metylacji. Jego przeznaczeniem jest ochrona komórki bakteryjnej przed zainfekowaniem DNA pochodzenia egzogennego. Za przykład niech posłuży system restrykcji i metylacji EcoRI. Jest to system obrony organizmu komórki bakteryjnej przed obcym DNA. W komórce bakteryjnej występują oba enzymy, to jest; metylaza EcoRI, oraz endonukleaza restrykcyjna EcoRI.

          Enzymy restrykcyjne (ang. restriction enzymes) są enzymami izolowanymi z bakterii, zdolnymi do rozpoznawania specyficznych sekwencji w DNA i przecinania dwuniciowej cząsteczki DNA. Ważną cechą produktów powstałych w wyniku trawienia DNA enzymami restrykcyjnymi jest to, że otrzymywane fragmenty DNA można rozdzielić na żelach w procesie elektroforezy. W ten sposób otrzymujemy obraz prążków żelu. W poszczególnych prążkach znajdują się cząsteczki DNA o identycznej sekwencji nukleotydowej. Dzięki temu możliwe stało się rozwiniecie technik badawczych pozwalających na precyzyjną obróbkę DNA.
          Poznane dotychczas enzymy restrykcyjne podzielono na trzy główne grupy. Enzymu klasy I są najbardziej skomplikowane pod względem budowy. Cecha charakterystyczna jest to, że po rozpoznaniu specyficznej dla siebie sekwencji enzymy te dokonują hydrolizy w pewnej odległości od rozpoznanego miejsca. Może to być nawet 1000 pz. Najbardziej przydatne w badaniach biologii molekularnej enzymy klasy II są jednostkami stosunkowo prostymi w budowie i hydrolizują nić DNA w miejscu rozpoznanej przez siebie sekwencji. Enzymy restrykcyjne typu II wymagają jako substratu dwuniciowej cząsteczki DNA, zawierającej, co najmniej jedną sekwencję rozpoznawaną przez dany enzym, oraz jonów magnezu. DNA zostaje przecięte w obrębie lub w okolicy sekwencji rozpoznawanej. Enzymy klasy III po rozpoznaniu miejsca specyficznego dla siebie dokonują cięcia w odległości około 25 pz od rozpoznanej sekwencji.
          Przykłady niektórych enzymów restrykcyjnych;







          Większość enzymów restrykcyjnych typu II rozpoznaje, palindromowe czyli posiadające oś symetrii, sekwencje cztero- lub sześcionukleotydowe są to tzw. enzymy czwórkowe lub szóstkowe. Nacięcia w obu niciach mogą leżeć naprzeciwko siebie i wówczas powstają, tzw. "tępe końce" (ang. bunt ends), np. enzym HaeIII z Haemophilus aegypticus rozpoznaje i przecina poniższą sekwencję, w wyniku, czego powstają "tępe końce".

          Z kolei enzym EcoRI pochodzący ze szczepu E.coli RY13 rozpoznaje sześcionukleotydową sekwencję, przecinając obie nici DNA tak, że powstają tzw. "lepkie końce" (ang. sticky ends) w postaci jednoniciowych czteronukleotydowych końców 5'.

          Niektóre enzymy produkują "lepkie końce", 3' które najczęściej składają się z 2 do 4 nukleotydów. Natomiast "lepkie końce" 5' to odcinki najczęściej od 2 do 6 nukleotydów. Wszystkie enzymy restrykcyjne pozostawiają grupę fosforanową na końcu 5', a grupę hydroksylową na końcu 3'. "Lepkie końce" mają duże znaczenie przy klonowaniu genów. Sekwencje "lepkich końców" powstałych w wyniku działania tego samego enzymu są komplementarne. W obecności enzymu ligazy można takie cząsteczki ponownie połączyć ze sobą kowalencyjnie. Nazewnictwo enzymów restrykcyjnych opiera się na literowych skrótach, w których pierwsza litera pochodzi od rodzaju bakterii, a druga i trzecia od gatunku. Następna litera oznacza szczep lub typ, natomiast kolejne enzymy z danego typu lub szczepu otrzymują liczby rzymskie. Enzymy pochodzące z różnych szczepów, ale rozpoznające te same sekwencje DNA, nazywają się izoschizomerami. Sytuacje taką mamy w przypadku enzymów HpaI, HpaII, MspI i BsuF, wszystkie one rozpoznają i hydrolizują sekwencje CCGG.
          Zdarza się, że dwa enzymy wytwarzają takie same "lepkie końce", mino, że rozpoznają różne sekwencje DNA. Enzym BamHI produkuje końce GATCC rozpoznając sekwencję GGATCC, zaś enzym BglII, wytwarzający takie same "lepkie końce", rozpoznaje sekwencję AGATCT. Dzieki temu możliwe jest klonowanie DNA strawionego BamHI w wektorze strawionym BglII, ale mieć na uwadze trzeba, że nie każdy sklonowany odcinek DNA będzie mógł być wycinany enzymem BglII. Enzym Sau3AI rozpoznaje z kolei sekwencji NGATCN, czyli również może stworzyć lepkie końce GATCC.

          Reakcje hydrolizy enzymami restrykcyjnymi polegają na odpowiedniej inkubacji analizowanego DNA i wybranych enzymów. Do pojedynczej reakcji trawienia używa się zwykle 0,2 - 1 ug DNA w roztworze o objętości 20 ul lub mniejszej. Ilość enzymu w mieszaninie reakcyjnej nie powinna być większa niż 10%. Ilości te określa się według różnych wytycznych. Na przykład przy zanieczyszczonym preparacie DNA stosuje się większą ilość enzymów restrykcyjnych dochodząc do 20 jednostek enzymu na 1 ug DNA. Jednostka enzymu restrykcyjnego to taka jego ilość, która trawi kompletnie, 1 ug DNA faga l (ok. 50 kd) w czasie 1 godziny w 37oC. Inkubację preparatów DNA z enzymami restrykcyjnymi prowadzi się w temperaturze 37oC w czasie 1 godziny lub dłużej. Przerwanie reakcji, co zwykle nie jest konieczne można przeprowadzić przez termiczną inaktywację enzymu w warunkach 15 minut w temperaturze 65oC lub dodając, EDTA pH 8.0 do końcowego stężenia 10 mM zachodzi wtedy chelatacja jonów magnezu. Szczegółowym źródłem informacji o enzymach restrykcyjnych oraz o ich termostabilności i wymaganiach, co do warunków reakcji są katalogi firm produkujących odpowiednie używane enzymy.
          Jeśli już otrzymaliśmy fragmenty DNA z tępymi lub lepkimi końcami to możemy również na tym etapie dzięki odpowiednim enzymom końce te modyfikować. Z tępego końca możemy zrobić lepki poprzez dołączenie dzięki enzymowi ligazie odcinków zwanych adapterami. Są to krótkie fragmenty DNA, które zakończone są z jednej strony tępo natomiast z drugiej posiadają lepki koniec. Wcześniej metylujemy genomowy odcinek DNA chroniąc go przed enzymami restrykcyjnymi, które wprowadzimy w kolejnych etapach a których celem będzie wytworzenie funkcjonującego lepkiego końca na fragmencie DNA dołączonym jako adapter. Jeżeli lepki koniec mający cofniętą nić 3` chcemy zamienić na koniec tępy to możemy to zrobić dzięki innemu enzymowi. Będzie to fragment Klenowa polimerazy DNA E.coli. Będzie tu jeszcze niezbędny komplet nukleotydów, z których enzym ten, dosyntetyzuje odcinki brakujące. Jeżeli w lepkim końcu cofnięta jest nić 5` to można go stępić wycinając wysunięty jednoniciowy odcinek DNA. Do tego procesu użyć można nukleazy S1 bądź też polimerazy I E.coli wykorzystując jej aktywność egzonukleolityczną 3` ->5`. Poniżej przedstawimy kilkanaście enzymów w tym oprócz restrykcyjnych kilka innych mających zastosowanie w biologii molekularnej.

          Polimeraza DNA I (polimeraza Kornberga)

          Enzym ten otrzymywany jest metodami biotechnologicznymi z komórek bakterii E. coli. W budowie jest to pojedynczy polipeptyd o masie 109 kD, mający 3 różne aktywności, są to właściwości; polimerazy DNA, egzonukleazy 3'->5' i 5'->3'. Funkcja polimerazy DNA wymaga matrycy jednoniciowego DNA (ssDNA) i primera DNA lub RNA z wolnym końcem 3'-OH.

          Enzym ten również to egzonukleaza 5'->3' degradująca dwuniciowe DNA, (dsDNA) lub hybrydy DNA-RNA od końca 5'-P.

          Jako egzonukleaza '3›5' degraduje dwuniciowe DNA (dsDNA) lub jednoniciowe, (ssDNA) od końca 3'-OH.
          Zastosowanie tego enzymu to min; znakowanie DNA metodą przesunięcia pęknięć (ang. nick translation). Inne zastosowanie to synteza nici cDNA w połączeniu z RNAzą H.

          Polimeraza DNA I (fragment Klenowa)

          Enzym ten otrzymujemy jako produkt proteolizy polimerazy Kornberga subtilizyną lub z rekombinantów E. coli syntetyzującego to białko ze zmienionego genu polA.
          W budowie jest to pojedynczy polipeptyd (75 kD), mający 2 różne aktywności; polimerazy oraz egzonukleazy 3'->5'. Wynikają z stąd jego właściwości. Jako polimeraza DNA 5'->3' wymaga matrycy jednoniciowego DNA (ssDNA) i primera DNA lub RNA z końcem 3'-OH.

          Egzonukleaza 3'->5' degradująca dwuniciowy DNA (dsDNA) lub jednoniciowy (ssDNA) od końca 3'-OH.

          Zastosowanie znalazł ten enzym przy; wypełnianiu i znakowaniu dwuniciowego DNA (dsDNA) z 5'-jednoniciowym lepkim końcem, przy znakowaniu ssDNA metodą wydłużania startera, przy syntezie drugiej nici cDNA, przy syntezie sond ssDNA, przy znakowaniu DNA metodą przesunięcia pęknięć.

          Polimeraza faga T4

          Otrzymujemy ten enzym z komórek bakterii E. coli zakażonych fagiem T4 lub z rekombinantów E. coli syntetyzującego to białko z klonowanego genu polimerazy T4.
          Zbudowany ten enzym jest jako pojedynczy polipeptyd o masie 114 kD, mający aktywności podobne do fragmentu Klenowa. Polimeraza T4 posiada bardziej aktywną egzonukleazę 3'->5'. Gdy enzym ten pełni funkcje polimerazy DNA 5'->3' wymaga matrycy jednoniciowego DNA (ssDNA) i primera DNA lub RNA z końcem 3'-OH.

          Jako egzonukleaza 3'->5' degraduje dwuniciowy DNA (dsDNA) lub jednoniciowy (ssDNA) od końca 3'-OH, co pozwala na przeprowadzanie reakcje wymiany z cząsteczkami dsDNA posiadającymi tępe lub 3'-lepkie końce.

          Zastosowanie to; wypełnianie i znakowanie dwuniciowego (dsDNA) z 5' jednoniciowym lepkim końcem, oraz znakowanie dsDNA przez reakcje wymiany.

          Polimeraza faga T7

          Do otrzymywania tego enzymu służą komórki bakteryjne gatunku E. coli, które zakażone są przez faga T7.
          W budowie jest to dimer złożony z produktu genu 5 faga T7 o masie84 kD i trioredoksyny E. coli o masie12 kD. Produkt genu 5 posiada aktywność polimerazy i egzonukleazy. Natomiast białko E. coli ściśle wiąże cały kompleks z matrycą DNA. Enzym ten jest funkcjonalnie podobny do fragmentu Klenowa, lecz charakteryzuje się szybszym stopniem syntezy DNA, czyli 300 nt/s. Właściwość polimerazy DNA 5'-.3' wymaga do aktywności matrycy jednoniciowego DNA (ssDNA) oraz primera DNA lub RNA z końcem 3'-OH.

          Funkcjonując jako egzonukleaza degradująca 3'->5', degraduje od końca 3'-OH dwuniciowy DNA (dsDNA) lub jednoniciowy DNA (ssDNA).

          Enzym ten używany jest wraz z fragmentem Klenowa, szczególnie w tych przypadkach, które wymagają dużej szybkości syntezy i dobrego wiązania z matrycą.

          Polimeraza Taq

          Do otrzymywania tego enzymu służą bakterie Thermus aquaticus lub rekombinant innej bakterii, czyli E. coli.
          Enzym ten w budowie zbliżony i funkcjonalnie podobny do polimerazy DNA I z E.coli. Specyficzna właściwość to; termostabilność w zakresie temperatur od 37°C do 94°C (optimum działania przy 80°C). Jako polimeraza DNA 5'->3' wymagająca do aktywności matrycy ssDNA oraz primera DNA lub RNA z końcem 3'-OH.

          Jako egzonukleaza 5'->3' degraduje od końca 5'-P dwuniciowy DNA (dsDNA) lub hybryd DNA-RNA.

          Enzym ten znalazł zastosowanie w amplifikacji DNA poprzez łańcuchową reakcję polimeryzacji (PCR), oraz w sekwencjonowaniu DNA metodą Sangera.

          Odwrotna transkryptaza

          Enzym ten otrzymujemy z kurcząt zainfekowanych wirusem AMV (ang. Avian Myeloblastosis Virus) lub po rekombinacji z komórek E. coli klonowanym genem AMV pol.
          Budowa tego enzymu to białko dimeryczne, które złożone z podjednostek o masach cząsteczkowych od 62 do 94 kD. Właściwości tego enzymu to; polimeraza 5'->3' wymagająca do aktywności matrycy ssDNA lub ssRNA oraz primera DNA lub RNA z końcem 3'-OH.

          Egzonukleaza 5'->3' i 3'->5' specyficzna dla RNA w hybrydzie DNA-RNA.

          Trzecia aktywność to aktywność DNA endonukleazy.
          Zastosowanie ten enzym znalazł w syntezie pierwszej nici cDNA, w sekwencjonowaniu RNA, w sekwencjonowanie DNA, oraz w znakowanie 3' końcowych fragmentów DNA.

          Polimeraza RNA E. coli

          Otrzymywanie tego enzymu związane jest z komórkami bakterii E. coli.           Budowa tego enzymu jest złożona. Holoenzym tego enzymu składa się z czterech podjednostek; 2alfa, ß i ß'. Polimeraza RNA wymaga nici DNA jako matrycy. Enzym ten syntetyzuje RNA aż do sekwencji terminatorowej.

          Zastosowanie tego enzymu to proces transkrypcji genów z właściwych promotorów in vitro, oraz synteza znakowanego RNA.

          Polimeraza RNA faga SP6

          Otrzymywanie tego enzymu wiąże się z bakteriami Salmonella typhimurium LT2 zakażonych fagiem SP6.
          W budowie jest to pojedynczy polipeptyd o masie cząsteczkowej 96 kD. Właściwości tego enzymu to; polimeraza RNA zależna od obecności matrycy DNA wysoce specyficzna w stosunku do promotora SP6.

          Zastosowanie tego enzymu to; produkcja antysensownego RNA, synteza mRNA w transkrypcji in vitro, otrzymywanie znakowanego RNA, oraz sekwencjonowanie RNA.

          Polimeraza RNA faga T3

          Otrzymywanie tego enzymu związane jest z rekombinantem E. coli zawierającym plazmid pCM56 z klonowanym genem polimerazy RNA T3.
          Jest to pojedynczy polipeptyd o masie cząsteczkowej około 100 kD. Enzym ten jest specyficzny dla promotorów T3. Jest to polimeraza RNA zależna od matrycowego DNA, wysoce specyficzna w stosunku do promotora T3.

          Zastosowanie to synteza transkryptów RNA pod kontrolą promotora T3, produkcja antysensownego RNA, synteza mRNA w transkrypcji in vitro, otrzymywanie znakowanego RNA, oraz sekwencjonowanie RNA.

          Polimeraza RNA faga T7

          Enzym ten otrzymywany jest z rekombinanta E. coli zawierającego plazmid pAR1219 z klonowanym genem RNA polimerazy T7.
          W budowie jest to pojedynczy polipeptyd o masie cząsteczkowej 98 kD. Enzym ten jest specyficzny dla promotorówT7. Polimeraza RNA faga T7 zależna jest od matrycy DNA, jest wysoce specyficzna w stosunku do promotora T7. Wektor zawierający promotor T7 może być zastosowany do otrzymywania 30ug transkryptu RNA z 1ug DNA matrycowego w ciągu 30 min.

          Zastosowanie to procesy; syntezy transkryptów RNA z sekwencji ligowanych pod kontrolą promotora T7, produkcja antysensownego RNA, synteza mRNA w transkrypcji in vitro, otrzymywanie znakowanego RNA, sekwencjonowanie RNA.

          Nukleaza Bal31

          Otrzymywanie tego enzymu związane jest z metabolizmem bakterii Alteromonas espejiana Bal31.
          Brak jest danych o budowie. Natomiast znamy właściwości tego enzymu. Egzonukleaza 3'->5' która progresywnie usuwa nukleotydy z końca 3'-OH cząsteczek ssDNA lub dsDNA mających zarówno kohezyjne (lepkie), jak i tępe końce.

          Endodeoksyrybonukleaza, z dużą specyficznością dla ssDNA.

          Kombinacja obu aktywności daje możliwość progresywnego skracania cząsteczek dsDNA.

          Zastosowanie tego enzymu to; kontrolowane cięcie cząsteczek dsDNA usuwające zbędne sekwencje przed klonowaniem, mapowanie restrykcyjne, oraz mapowanie drugorzędowych struktur DNA.

          Nukleazy S1

          Enzym ten otrzymywany jest z grzyba, Aspergillus oryzae.
          Enzym ten ma złożoną budowę. Jest to metaloproteid o masie cząsteczkowej 32 kD, jest to białko wysoce termostabilny. Właściwość tego enzymu to endonukleaza specyficzna dla jednoniciowego kwasu nukleinowego, bardziej aktywna dla ssDNA, niż ssRNA.

          Zastosowanie tego enzymu to; analiza hybryd DNA-RNA (mapowanie nukleazy S1) w celu lokalizacji intronów i terminacji transkrypcji, usuwanie lepkich końców w celu tworzenia cząsteczek tępymi końcami, oraz otwieranie struktur "szpilki od włosów" (ang. hairpins) tworzących się podczas syntezy cDNA.

          Rybonukleaza A

          Enzym ten otrzymywany jest z trzustki wołowej.
          Jest to bardzo aktywny i stabilny enzym o masie cząsteczkowej 13,7 kD.
          Enzym ten wykazuje właściwości endorybonukleazy przecinającej fosfodiestrowe wiązanie 3' przy pirymidynach. Nie wykazuje żadnej aktywności w stosunku do DNA.

          Zastosowanie tego enzymu to; usuwanie RNA z preparatów DNA, oraz mapowanie punktowych mutacji w DNA i RNA.

          Rybonukleaza H

          Enzym ten otrzymywany jest z rekombinowanego szczepu E. coli zawierającego gen RNAzy H w plazmidzie pBR322.
          Jest to małe białko o masie cząsteczkowej 15,5 kD. Jest to endorybonukleaza specyficzna dla RNA w hybrydach DNA-RNA.

          Enzym ten stosowany jest w syntezie komplementarnej nici cDNA, przy usuwaniu ogonów poli(A) z mRNA, przy wykrywaniu hybryd DNA-RNA, oraz badanie starterów RNA w syntezie DNA.

          Deoksyrybonukleaza I

          Otrzymuje się ten enzym z trzustki wołowej.
          Jest to glikoprotein o masie cząsteczkowej 31 kD.
          Właściwości tego enzymu to; endodeoksyrybonukleaza degradująca ssDNA i dsDNA poprzez preferencyjne cięcie 5'-pirymidyn dając mono- i oligonukleotydy o przeciętnej wielkości 4 nukleotydów.

          Zastosowanie tego enzymu to; wprowadzanie nacięć do dsDNA przed znakowaniem metodą przesunięcia pęknięć (ang. nick translation), usuwanie DNA podczas preparowania RNA, wykrywanie regionów transkrypcyjne aktywnych chromatynie, oraz usuwanie matrycy DNA po transkrypcji in vitro.

          Egzonukleaza III

          Enzym ten otrzymujemy z bakterii E.coli BE 257 lub SR 80 z klonowanym do plazmidu pSGR3 genem.
          Jest to białko monomeryczne o masie cząsteczkowej 28 kD. Enzym ten jest nieaktywny w stosunku do ssDNA lub dsDNA z lepkimi końcami 3' wielkości 4 lub więcej nukleotydów. Właściwości tego enzymu to; właściwość egzodeoksyrybonukleazy specyficznej dla dsDNA z końcami 3'-OH.

          Jako 3' fosfataza usuwająca grupy fosforanowe z końców 3' ssDNA lub dsDNA.

          Endorybonukleaza specyficzna dla RNA w hybrydach RNA-DNA.

          Zastosowanie tego enzymu to; tworzenie zachodzących na siebie subklonów w sekwencjonowaniu DNA, znakowanie tępych końców dsDNA, w połączeniu z działaniem fragmentu Klenowa, delecja sekwencji terminalnych we fragmentach dsDNA w połączeniu z działaniem endonukleazy specyficznej do ssDNA.

          Fosfataza alkaliczna

          Enzym ten otrzymujemy z jelita cielęcego (jest to fosfaaza CIP) lub z komórek E.coli (jest to fosfataza BAP).
          W budowie jest to glikoproteina o masie cząsteczkowej 69 kD z czterema atomami Zn. Właściwości tego enzymu to; 5' fosfataza usuwająca 5' grupę fosforanową z ssDNA i dsDNA, ssDNA i dsDNA.

          Zastosowanie tego enzymu to; defosforylacja dsDNA w celu uniemożliwienia autoligacji, oraz defosforylacja DNA i RNA do znakowania końców 5' za pomocą kinezy polinukleotydowe T4.

          Terminalna deoksynukeotydylo transferaza (TdT)

          Otrzymywanie tego enzymu wiąże się z trzustka cielęca.
          W budowie jest to białko dimeryczne złożone z dwóch podjednostek o masach cząsteczkowych 80 kD i 26 kD. Właściwość tego enzymu to funkcja polimerazy DNA matrycowo-zależnej dosyntetyzującej deoksynukleotydy do końców 3'-OH na ssDNA lub dsDNA.
          Sytuacja ssDNA lub dsDNA z lepkimi końcami 3' o długości, co najmniej 2 nt;

          Teraz przypadek dsDNA z tępymi końcami;

          Zastosowanie ten enzym znalazł przy; tworzeniu homopolimerowych ogonów na końcach fragmentów, oraz znakowaniu końców 3' znakowanym 3'-dNTP lub 3'-NTP.