Strona
Główna

Badania
Molekularne

Analiza
Statystyczna

Analiza
Informatyczna

Linki
Kontakt

Forum
Dyskusyjne



           Pobieranie materiału biologicznego i ekstrakcja DNA
           Identyfikacja genów cech ilościowych QTL (Quantitative Trait Loci)
           Markery genetyczne i ich zastosowanie w praktyce hodowlanej
           Kontrola pochodzenia zwierząt
           Tworzenie genetycznych map sprzężeniowych genomów zwierząt gospodarskich
           Podstawy procesu elektroforezy
           Podstawy polimerazowej reakcji łańcuchowej PCR (Polymerase Chain Reaction)
           Hybrydyzacja kwasów nukleinowych
           Enzymy restrykcyjne jako molekularne narzędzia do przeprowadzania badań.
           Zobaczyć DNA!




Genetyka molekularna w praktyce hodowlanej


          Genetyka molekularna zwierząt wspomagając hodowle umożliwia zastosowanie niekonwencjonalnego przeprowadzania selekcji. Dzięki jej metodom otrzymujemy nową jakość w procesie przeprowadzaniu selekcji. Dzięki diagnozie molekularnej osobników w bardzo młodym wieku, czy też wręcz zarodków, możliwe jest poszukiwanie wskaźników zwanych markerami, które to dostarczają informacji o potencjale genetycznym danego osobnika. Dzięki temu odszymujemy kryterium według którego możemy zadecydować o przyszłym wykorzystaniu tego zwierzęcia.
          Najczęściej poszukujemy genów mięsności lub płodności bądź to genów warunkujących różne schorzenia. Są to cechy najistotniejsze z gospodarczego punktu widzenia. Jeżeli badaniu poddany będzie osobniki w okresie młodzieńczym, to jeszcze przed fenotypowym przejawianiem się cech warunkowanych przez te geny możemy z dużym czy wręcz bardzo dużym prawdopodobieństwem rokować o przyszłej użytkowej lub hodowlanej ich wydajności. Pozwala nam to znacznie wcześniej podjąć decyzje o sposobie utrzymania i żywienia w zależności od grupy produkcyjnej, do której zaszeregujemy poszczególne osobniki. Możliwość taka istnieje jeszcze, gdy mamy doczynienia z zarodkami lub też gametami. Selekcje taką zwaną selekcją pośrednią określa się skrótem MAS od angielskich słów, marker assisted selection, czyli selekcji wspomaganej markerami.
          Jednak by selekcja taka miała merytoryczne podstawy niezbędne jest sprawdzenie czy typowany gen kandydat jest dobrym markerem genetycznym dla rozpatrywanej cechy. Gdy znamy genotyp badanych osobników wykonujemy określenie wartości cech, których związek z badanym genem sprawdzamy. Określamy, więc różne wskaźniki użytkowości celem ich skonfrontowania z wynikami genotypowania. Mogą to być na przykład cechy użytkowości tucznej, rzeźnej bądź rozpłodowej lub inne w danym momencie rozpatrywane, które określamy tradycyjnymi metodami.
          Badania prowadzone w ten sam sposób mogą posłużyć do określania różnic i podobieństw pomiędzy populacjami lub rasami. Wystarczy otrzymane wyniki z badań molekularnych zastosować z połączeniem z metodami genetyki populacyjnej. W ten sposób określamy różnice w strukturach genetycznych poszczególnych grup zwierząt. Jest to temat bardzo szeroki gdyż coraz szerzej stosujemy metody genetyki molekularnej w hodowli zwierząt domowych i hodowlanych.
          Szukanie związków pomiędzy genami o wartością hodowlaną jest podstawowym badaniem molekularnym w hodowli zwierząt. Przebieg pracy nad takim doświadczeniem w uproszczeniu może być następujący. Najpierw musimy wytypować gen kandydat, który po wstępnej analizie literatury rokuje nadzieje na wyraźną zależność z cechami użytkowymi, które zamierzamy badać u zwierząt, od których posiadać będziemy materiał do analiz. Odszukujemy dane o jego sekwencji a szczególnie interesują nas sekwencje starterów potrzebnych do procesu polimerazowej reakcji łańcuchowej, w skrócie PCR, od angielskich słów Polymerase Chain Reaction. Na tym etapie pracy, niezastąpionym narzędziem stają się internetowe bazy danych, w których zbierane są tego typu informacje z całego świata. Podstawowa sprawa to zdobyć primery specyficzne dla genu, którym planujemy się zająć. Oczywiście niezbędne jest zbieranie materiału biologicznego, który posłuży do badań. Mogą to być oczywiście zebrane i zamrożone wcześniej próbki, lub nowy świeży materiał, najczęściej krew.
          Pobieramy 5-10 ml krwi żylnej do probówek zawierających entykoagulant najlepiej wersenian lub cytrynian. Jest to najczęściej najpowszechniej używane EDTA. Później przeprowadzamy proces amplifikacji ze specyficznymi dla tego odcinaka starterami. W zależności od specyfiki analizowanego loci wybieramy jedną z metod analizy; RFLP, VNTR, STR, RAPD. Uzyskany produkt poddajemy trawieniu przez określony, odpowiednio dobrany enzym restrykcyjny. Jest to etap niezbędny do określenia genotypu w badanym loci. Trawienie to w temperaturach bliskich 35°C, odbywa się kilka czy kilkanaście godzin. Zależy to od ilości DNA do strawienia i ilości podanego enzymu oraz podlega innym zależnościom typowym dla reakcji enzymatycznych. Następny etap to elektroforeza w żelu najczęściej agarozowym, 5-cio procentowym. Jego gęstość określamy przewidując rząd wielkości charakteryzujący spodziewany produkt trawienia, Im żel gęstszy tym możliwe staje się rozdzielenie mniejszych fragmentów DNA. Ale również wydłuża się czas potrzebny na ten rozdział. By uwidocznić DNA po rozdziale, wcześniej dodawany jest bromek etydyny. Potrzebny jest on, gdyż świeci pod wpływem światła UV uwidaczniając DNA. Na podstawie prążków na żelu powstałych w procesie elektroforezy określamy ilość alleli obecnych w badanej populacji. Następny krok to scharakteryzowanie pod względem genotypu w tym lokus każdego z przebadanych osobników. Na przykład, dla uproszczenia przyjmiemy, że produkty uwidocznione w elektroforezie wskazują na obecność tylko dwóch form allelicznych badanego genu. Nadajemy im wtedy określone symbole, np. A i a, następnie charakteryzujemy wszystkie osobniki pod względem genetycznym dzieląc na te, które są homozygotami i heterozygotami, czyli mamy tu; AA, Aa i aa.
          Jeżeli badane próbki pobrane zostały od dużej ilości osobników to mamy doczynienia ilość pewnego rodzaju populacją, którą można scharakteryzować genetycznie. Liczymy teraz ilość osobników heterozygotycznych i homozygotycznych pod względem każdego allelu. Genetyka populacji pozwala nam po uzyskaniu tych danych rozpocząć pierwszą cześć analizy. Metodami konwencjonalnymi możemy uzyskać bardzo wiele informacji na temat genetycznej struktury przebadanej populacji.
          Teraz możemy przystąpić do najważniejszego momentu, czyli sprawdzamy czy uzyskane dane pozwalają stwierdzić czy typowany przez nas gen rzeczywiście w sposób istotny statystycznie koreluję z cechami użytkowymi wziętymi pod uwagę w badaniach. Pomocna tu, a wręcz niezastąpiona będzie statystyka, i jej metodami wykorzystywanymi w doświadczalnictwie. Jeżeli z analiz wynika, że zwierzęta o określonym genotypie wyraźnie przewyższa je inne pod względem cech genotypowych to mamy dobry wskaźnik, który może być zastosowany w selekcji genotypowej przed właściwą oceną wartości fenotypowej.
          Inny problem w rozwiązywaniu, którego pomocne mogą być metody genetyki molekularnej to częste pomyłki przy tworzeniu rodowodów dla zwierząt celem wpisu do ksiąg hodowlanych bądź też celem zastosowania różnych metod oceny hodowlanej. Poprzez niedopatrzenia umyślne lub taż nie, potomstwo może na przykład zostać przypisane innym rodzicom. Wynikła z tego komplikacje mogą uczynić całkowicie niemiarodajnymi wyniki oceny. Genetyka molekularna daje nam narzędzia do 100 procentowego weryfikowania pokrewieństw pomiędzy analizowanymi osobnikami.
          Wspomniana ocena zwierząt jest kluczowym elementem procy hodowlanej. Dla efektywność doskonalenia zwierząt gospodarskich ważne jest by uzyskać jak najwyższą dokładności oszacowania wartości hodowlanej. Nie będziemy w tym miejscu zajmować się tradycyjnymi sposobami ocena wartości hodowlanej jednak bardzo ważnym czynnikiem jest tu wiarygodność danych dostarczanych do analizy. To właśnie na skrupulatności zapisów wydajności poszczególnych osobników oraz na dokładnym prowadzeniu dokumentacji procesu rozrodu opiera się poprawność metod szacowania wartości hodowlanej. Dlatego też jednoznaczne i bezpośrednie określenie genotypów przy zastosowaniu metod genetyki molekularnej jest najdoskonalszym niepodważalnym czynnikiem o szczególnie ważnym znaczeniu praktycznym.
          Z rodowodami łączy się kolejny aspekt genetyki. Zastosowanie genetyki molekularnej znalazło również uzasadnienie w badaniach zarezerwowanych dotychczas dla genetyki tradycyjnej. Mowa tu o ocenie współczynników pokrewieństwa, o szacowaniu homozygotyczności zwierząt pod względem genów identycznych dzięki pochodzeniu, czyli współczynnik inbredu. Również badania ewolucyjne czerpią garściami z molekularnych badań, dzięki molekularnej charakterystyce populacji, ras lub też linii zwierząt, oceny dystansu genetycznego między populacjami czy gatunkami. Materiał biologiczny wraz z uzyskanym z niego materiałem genetycznym pochodzący ze stanowisk wykopaliskowych zwierząt już wymarłych, może być analizowany po uprzednio udanej reakcji PCR. Ważnym celem, jaki umożliwia metoda PCR wraz z późniejszymi metodami obróbki i analizy, jest dokładne poznawanie genomu zwierząt domowych, w szczególności genomu zwierząt ginących. Najszerzej stosowana w praktyce hodowlanej metodą pochodzącą z laboratorium genetyki molekularnej jest PCR. Pierwsze doniesienia jej zastosowaniu w badaniach zootechnicznych pojawiły się w 1994 roku. Dotyczyły wartości hodowlanej buhajów rasy simentalskiej, przy zastosowaniu określania genotypu pod względem genu dla hormonu wzrostu. Wykazano wtedy, że buhaje, u których stwierdzono heterozygotyczność LV miały wyższą wartość hodowlaną pod względem cech użytkowości mięsnej, natomiast te buhaje, które były homozygotami VV uzyskiwały lepsze oszacowania wartości hodowlanej pod względem cech mleczności. Rasa simentalska jest użytkowana w obu z tych kierunków hodowlanych, więc wyniki te umożliwiały wczesne uszeregowanie poszczególnych osobników do grup o określonym profilu produkcyjnym. Mamy, więc dopiero blisko 10 letnią praktyka w stosowaniu tej metody w hodowli a jest ona już nieodzownym narzędziem znanym każdemu, kto z badaniami zootechnicznymi ma coś wspólnego.
          Wykrywanie mutacji odpowiedzialnych za choroby to również zadanie genetyków molekularnych. Już nie wystarczy zbadanie samego mechanizmu dziedziczenia i nadanie zmutowanemu allilowi symbolu. Dzisiejsza praktyka hodowlana dąży do opracowania coraz prostszych i szybszych metod genotypowania i odnajdywania osobników z taką wad genetyczną. Mutacje są to skokowe zmiany w materiale dziedzicznym, zachodzące spontanicznie bądź też na skutek działania czynników mutagennych. Większość mutacji pozostaje niezauważona jednak, niektóre z nich prowadzą do chorób genetycznych. Dlatego też, wiele z chorób o podłożu genetycznym spowodowana jest prostymi mutacjami punktowymi, które prowadzą do zmiany sekwencji aminokwasów kodowanego białka.
          Zmiana sekwencji nukleotydów, która jest po prostu zamiana jednej zasady azotowej na inna pociąga za sobą zmianę sekwencji aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym. Pamiętać należy, że pozornie mała zamiana w obrębie łańcucha polipeptydowego może spowodować kolosalną zmianę w budowie wyższorzędowej białka. W świecie makromolekuł, w którym wszystko jest bardzo precyzyjne konsekwencją zmiany budowy przestrzennej będzie częściowa lub całkowita utrata jego funkcji biologicznej. Zmiany funkcjonalne pociągają nienormalny metabolizm komórkowy, czego ostateczną konsekwencją będzie wada genetyczna. Aktualnie znamy u zwierząt gospodarskich liczne mutacje genowe powodujące znaczące choroby genetyczne, wiele spośród nich ma charakter letalny. Również i tu jesteśmy w stanie wiele spośród nich diagnozować dzięki poznaniu genów za nie odpowiedzialnych lub sprzężonych markerów.

          - BLAD, czyli niedobór leukocytarnych cząsteczek adhezyjnych,
          - Citrulinemia, gdy brak jest syntetazy arginino-bursztynianowej,
          - DUMPS w przypadku brak enzymu syntezy monofosforanu urydyny,
          - polimorfizm typu RFLP w pobliżu genu odpowiedzialnego za hemofilię A u owiec,
          - Kardiomiopatia u bydła,
          - i wiele innych.

          To tylko garstka schorzeń o podłożu genetycznym opisanych u każdego z gatunków. Wystarczy wziąć jakiś katalog na ten temat by się przekonać, że mówimy o setkach a nawet dziesiątkach tysięcy u każdego z gatunków.
          W wielu przypadkach podczas procesu produkcyjnego zainteresowaniu jesteśmy skuteczną kontrolą i regulacją płci u potomstwa uzyskiwanego w procesie hodowlanym. U ssaków płeć organizmu zostaje jednoznacznie poza nielicznymi wyjątkami zdeterminowana w momencie połączeń gamet, czyli w czasie zapłodnienia. Komórka jajowa zawierająca zawsze chromosom X może połączyć się połączy się z plemnikiem, u którego chromosomem płciowy może być X jak również Y. Rozdział płci jest zawsze równomierny lub bardzo zbliżony do równości, dlatego obu płci rodzi się tyle samo. W hodowli zależy nam czasem na posiadaniu przewagi jednej z płci. Na przykład przy bydle mlecznym na samicach a w hodowli ras mięsnych na samcach. Regulacja płci zwierząt gospodarskich ma, więc duże znaczenie praktyczne, zwłaszcza w hodowli.
          Również w tym przypadku poszukiwanie metodami genetyki molekularnej sekwencji specyficznych dla odmiennych chromosomów może nam pomóc w identyfikacji płci jeszcze u kilkukomórkowych zarodków. W metodzie tej analizowanymi sekwencjami nukleotydowymi na chromosomach płciowych, czyli Y lub X. Dzięki szczegółowym badaniom chromosomów płciowych poznano wiele sekwencji specyficznych. Największą grupę stanowią anonimowe sekwencje powtarzalne. Ze względu na ważny dla rozwoju organizmu proces determinacji płci poznano również unikalne sekwencje kodujące. Występują one zarówno na chromosomie X, jak i Y. Determinacja płci w kierunku osobnika męskiego rozpoczyna się uruchomieniem funkcji obecnego na chromosomie Y genu TDF, czyli czynnika determinującego jądra. Dzięki badania genetyki molekularnej wiemy, że gen ten posiada analogiczny swój odpowiednik na chromosomie X. Mamy, więc dwa allele różniące się sekwencją nukleotydową; gen ZFY (zinc finger Y-protein) i gen ZFX (zinc finger X-protein). Dzięki procesowi, PCR prowadzona jest amplifikacja fragmentów obu z genów, które dają produkt różnej długości; jest to cząsteczka o długości 247 pz w przypadku genu ZFX i druga o długości 167 pz w przypadku genu ZFY. Późniejsza analiza restrykcyjna, czyli łącznie procedura zwana PCR-RFLP daję nam pewność, co do uzyskanego amplifikowanego fragmentu.
          Innym analizowanym genem może być gen amelogeniny, którego znajdujemy zarówno na chromosomie X jak i Y. Geny te jednak różnią się sekwencja w zależności od tego, na którym chromosomie występują. Dzięki odpowiednio dobranych specyficznym starterom uzyskujemy produkt amplifikacji fragmentu o długości, 280 pz odpowiadający temu reprezentującemu gen na chromosomie X i drugi allel o długości 217 pz, czyli jest to gen występujący na chromosomie Y. Analiza prążków elektroforetycznych daje nam odpowiedź na pytanie o płeć zarodka lub chromosom płciowy plemnika.
          Metoda PCR znajduje coraz szersze zastosowanie między innymi w diagnostyce chorób zwierząt domowych. Wykorzystuje się ją, więc do wykrywaniu chorobotwórczych wirusów, bakterii, czy pasożytów. Często prawidłowa gatunkowa identyfikacja pasożytów tkankowych była utrudniona ze względu na duże podobieństwo morfologiczne ich jaj i form larwalnych. PCR i analiza amplifikowanych rejonów genomu pozwoliły rozwiązać ten problem. Możliwe stało się prawidłowe oznaczania poszczególnych form rozwojowych i dorosłych pasożytów o podobnej budowie morfologicznej, skomplikowanym cyklu rozwojowym z wieloma żywicielami pośrednimi i ostatecznymi. Nie bez znaczenia jest też czas testu. Hodowla tradycyjna na szalkach w klasycznej hodowli trwa często kilka tygodni. Przy zastosowaniu metody PCR czas diagnozy skraca się do 1 dnia. Metoda ta jest tak czuła, że pozwala na przeprowadzenie badania na zachowanych tkankach organizmów od dawna nieżyjących. Właśnie metodą PCR określano organizmy pasożytujące na ludziach w starożytnym Egipcie dzięki analizie materiału biologicznego uzyskanego z mumii.
          Wymienione tu przykłady zastosowania genetyki molekularnej w hodowli to dopiero początek już wykonywanych badań. Wiele innych możliwości analiz jest potencjalnie możliwych do wykonania za pomocą metod powstałych na użytek dziedzin takich jak genetyka molekularna czy inżynieria genetyczna.